基因表达检测---RT-PCR.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因表达检测,第三部分：,RT-PCR,(Reverse transcription PCR),Reverse Transcription PCR,RNA,抽提,cDNA,反转录,基因特异性引导,Oligo(dT),引导,随机六核苷酸引物引导,PCR,Northern Blotting,基因表达分析,Northern Blotting,Awarded Nobel Prize for Chemistry in 1993.,基因表达水平,（梁大成等，,2006,）,表达增强克隆的,RT-PCR,和,Northern,杂交分析,ladder,c 1 3 5 7,c 1 3 5 7,c 1 3 5 7,c 1 3 5 7,c 1 3 5 7,EI12I1,EI22F22,EI1K8,EI35I3,-,actin,A,B,C,D,E,A:IRBB10,叶片接种,白叶枯（,PXO86,）,C:C101A51,叶接种,稻瘟病（,V86013,）,B:IRBB13,叶片接 种,白叶枯（,PXO99,）,D:MH63,叶片接种,稻瘟病（,V86013,）,E:MH63,叶片接种,稻瘟病（,1366,）,（周斌，,2001,，硕士论文）,mRNA,反转录生成的,cDNA,可作为,PCR,的模板进行扩增称为,RT-PCR,，,RT-PCR,比,Northern,杂交更灵敏，对,RNA,的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。,实验原理,被污染的试剂，缓冲液,移液器,使用的器皿及,tip,等,操作者的手，头发等,RNA,操作中应注意的问题：,防止,RNase,污染,外源,RNase,的主要来源：,当处理,RNA,时，移液器专用,保证,RNA,实验用的玻璃器皿、塑料制品和缓冲液等留出专用；,溶液和试剂分装成小份保存；,RNA,电泳装置专用（清洗、处理、,DEPC,处理过的水冲洗）；,防止外源,RNase,污染的主要措施,(,一）：,准备所有的溶液和缓冲液时，使用无,RNA,酶的玻璃器皿，,DEPC,处理过的水，用于,RNA,的化学药品使用专用药勺或直接敲击瓶底分离，可能的话，用,0.1,的,DEPC,在,37,C,处理溶液,1,小时后在,15psi(1.05kg/cm,2,高压蒸气灭菌,15min,。,180,300,C,烘烤玻璃器皿,4hrs,以上或用其它灭活,RNA,酶的商品化产品处理塑料制品；,使用新的、无,RNA,酶的一次性,tubes,tips,等；,在分离,RNA,的过程中用,RNA,酶抑制剂以抑制,RNA,酶的活性。,防止外源,RNase,污染的主要措施,(,二）：,材料要新鲜,;,裂解过程要同,RNase,活性抑制同步,防止内源,RNA,酶降解,RNARNA,酶抑制剂,RNA,酶是一种很顽固的酶，在,RNA,分离和鉴定的各个阶段严重威胁,RNA,的完整性。用来使,RNA,酶不发挥作用的,RNA,酶抑制剂主要有：,DEPC,氧钒核糖核苷复合物,RNA,酶的蛋白质抑制剂,DEPC:,是高度活性的烷基化试剂，通过组胺基团乙氧基甲酸化形式破坏,RNase,的活性,O,C,C,O,O,-CH,2,-CH,3,-CH,2,-CH,3,氧钒核糖核苷复合物,:,能与多种,RNA,酶活性位点结合并几乎百分之百地抑制,RNA,酶的活性,RNA,酶蛋白质抑制剂,Ribonuclease Inhibitor,可与,RNase,形成非共价的复合物，从而使,RNA,酶失活。不能在变性剂如,SDS,、胍等存在的情况下使用。,RNA EXTRACTION(mini prep),RNA,的制备与分析对于了解基因在转录水平上的调节和,cDNA,的合成都是必须的，,RNA,的纯度和完整性对于,Northern blot,RT-PCR,和,cDNA,文库的构建等分子生物学实验都至关重要。,RNA,分离的方法很多，最关键的因素是尽量减少,RNA,酶的污染。,实验目的：,学习,RNA,的简易制备过程，通过,RNA,电泳带评价,RNA,质量,实验材料：,水稻幼嫩叶片,苯酚,/,氯仿反复抽提，价廉但质不优，尤其是对多酚等含量高的材料不适,蛋白酶,/SDS,配合酚、氯仿抽提的方法,强变性剂法。硫氰酸胍，盐酸胍等，可 配合氯化铯离心或有机溶剂提取。,Trizol Reagent,提取方法：,利用,Trizol,试剂 抽提植物总,RNA,Trizol,试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总,RNA,的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持,RNA,的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，,RNA,处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀,RNA,。,用这种方法得到的总,RNA,中蛋白质和,DNA,污染很少，可以用来做,Northern,RT-PCR,分离,mRNA,，体外翻译和分子克隆等。,75,乙醇（,in DEPC-treated water),氯仿,异丙醇（,RNA,专用）,RNase-free water,：,Draw water to RNase-free glass bottles.Add diethylpyrocarbonate,（,DEPC,）,to 0.1%.Let stand overnight and autoclave.,防止外源,RNase,的污染：,应戴口罩和手套，环境洁净；玻璃器皿,180,C,烘烤,3hrs,以上；塑料制品,DEPC,水清洗，蛋白质变性剂处理；一次性用品如,tube,tip,等使用新的，无,RNA,酶的产品。,RNA,抽提前应准备的其它试剂及物品：,操作步骤（一）,液氮磨样，每管分装,0.1,克样品；,每管加,1,毫升,Trizol,试剂（样品体积不超过,Trizol,试剂体积的,10,），迅速混匀（若样品较多可先将混好的样品置于冰上）；室温下净置,5,10,分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离；,加,200,l,的氯仿，用手剧烈摇荡,15,秒，室温下静置,5,分钟左右；,4.2-8,，,12000,g,离心,10-15,分钟；,将水相（上清）转入一新离心管，加,0.5ml,异丙醇室温下沉淀,10,分钟；,2-8,，,12000,g,离心,15,分钟；,弃上清，加,1ml 75,乙醇清洗,RNA,，振荡片刻后（务必使沉淀悬浮起来，以确保洗涤干净），,7500g,离心,5,分钟，小心弃上清；,室温静置,5,15,分，使,RNA,沉淀恰好干燥，加入,20,l,DEPC,水溶解，保存于,-70,。,取,2,l,琼脂糖电泳检测,RNA,质量。,操作步骤（二）,RNA,的琼脂糖凝胶电泳,用乙二醛,/,甲酰胺对,RNA,进行预变性，然后进行琼脂糖凝胶电泳,用甲醛和二甲基亚砜对,RNA,进行预处理，在含,6,或,2.2mol/L,甲醛的凝胶中电泳,检测,0.5,TBE,In 1 MOPS,80 150V 40 min 1h30min,电泳,有溴化乙锭存在时，电泳后,28S rRNA,和,18S rRNA,在紫外灯下应当很清楚的看得到，还应当有一条由,tRNA,，,5.8S rRNA,和,5S rRNA,组成的较模糊的迁移较快的带。如果,RNA,没有降解，,28S rRNA,的亮度应当是,18S rRNA,的,2,倍，且这两条带都没有弥散现象。,What does good or bad total RNA look like when separated in gel?,Callus,Leaf,Degradation,Contaminant,Good,RNA,产量低的原因,样品研磨不彻底，没有混匀，裂解不彻底,RNA,没有完全溶解,RNA,降解的主要原因,取样后没有立即抽提,RNA,；,抽提过程中超作不当，样品量超过了许可的范围；,样品运输、保藏不当，或,RNA,保藏不当，应放入,-70,，而不是,-20,）,使用的溶液或器皿有,RNase,污染,琼脂糖变性胶（甲醛）电泳时,pH,值低于,3.5,DNA,污染的原因,样品太多，所加试剂相对太少,用来分离,RNA,的样品中含有机溶剂（乙醇，,DMSO,等），或碱溶液等,RT-PCR,(Reverse transcription PCR),实验目的：,学习,RT-PCR,的原理及其操作过程,实验材料：,水稻幼嫩叶片,RNA,目前,PCR,技术只能扩增,DNA,模板，对,RNA,模板不能直接扩增。,mRNA,反转录生成的,cDNA,可作为,PCR,的模板进行扩增，这种在,mRNA,反转录后进行的,PCR,扩增称为,RT-PCR,。,RT-PCR,比,Northern,杂交更灵敏，对,RNA,的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。,实验原理,DNase I,:,是将单链或双链,DNA,同等程度的随机分解，生成具有,5,P,末端寡核苷酸的脱氧核糖核酸内切酶。,Mg,2+,存在时，能在双链上产生切口；而,Mn,2+,存在下能将双链,DNA,同时切断，使,DNA,片断化。,活性定义：以小牛胸腺,DNA,为底物，在,25,C,、,pH5.0,的条件下，,1,分钟内使反应液的,260nm,吸光度增加,0.001,所需要的酶量定义为,1,个活性单位。,用途：,与,DNA Polymerase I,一起用于切口平移,体外转录后除去模板,DNA,Mn,2+,存在下为鸟枪法测序（,shot gun sequencing),制作,DNA,文库,用于足迹法（,foot printing),分析,DNA-,蛋白质相互作用,单链多肽，具有聚合酶和较弱的,RNase H,活性（或,RNase H,），最适反应条件：,37,C,pH8.3,反转录酶：依赖于,RNA,的,DNA,聚合酶,鼠白血病毒反转录酶,M-MLV,：,禽成髓细胞反转录酶,AMV,2,条多肽链，具有聚合酶活性和较强的,RNase H,活性，最适反应条件,41-45,C,，,pH8.3,比,pH7.6,活性高,RNase H,：,催化,DNA-RNA,杂合体的,RNA,部分的降解，产生不同链长带,3,羟基和,5,磷酸末端的寡核苷酸。,Ribonuclease Inhibitor,单一多肽，可与,RNaseA,形成,1,：,1,非共价的复合物，从而使,RNA,酶失活。不能在变性剂如,SDS,、胍等存在的情况下使用。活性表达需要巯基化试剂（,DTT,）,本实验以水稻叶片,RNA,为材料，检测转基因水稻,gus,基因的表达。实验中设置一个看家基因作为阳性对照，判断,RNA,的定量及反转录、,PCR,等过程是否有问题；设置一个不加模板,RNA,的阴性对照，主要是消除,DNA,及,PCR,试剂方面引起的假阳性；,PCR时设置一个以叶片,DNA,为模板的阳性对照，检验扩增带型是否来源于反转录的,cDNA,实验设计,操作步骤（一）,RNA Preparation,Prepare the plant total RNA by TRIzol Reagent.,Dilute the Total RNA to the final concentration of 1,g/,l by DU640.,Combine the following in a 0.5 ml sterile eppendorf tube:,Total RNA,3,l,(2-5,g),RNase-free DNase,l(,u/,l),10 DNase,buffer 1,l,add DEPC-treated ddH,2,O 5,l,Incubate at 37 for 15 min,then 70 for 10 min.,操作步骤（二）,Reverse Transcriptase Reaction,Add 1,l 500,g/ml oligo(dT)15 primer,mix the contents of the tube by gently vortexing and collect the reaction by brief centrifugation.,Heat the mixture at 70,dry bath for 10 minutes,then put on ice for 5 minutes.,Add the following contents:,5 first strand buffer4,l,RRI1,l,10,m,M dNTP 1,l,M-MLV(200 U/,l),1,l,DEPC H2O,2,l,操作步骤（二）,4.incubate at 37,for 1 h.(The total volume should now be 20,l),5.Inactive the reaction by heating at 70,for 15 min,then add 20,l ddH,2,O and the first strand of cDNA can be used as a template to amplification in PCR.,6.To remove the RNA complementary to the cDNA,add 1,l(2 units)of RNase H and incubate at 37,for 20 min.,PCR,技术,PCR,（多聚酶链式反应,是一种体外扩增特异,DNA,片段的技术，是分子克隆技术中最常用的技术之一，是在模板,DNA,、引物和,dNTPs,的存在下依赖于,DNA,聚合酶的酶促反应。,PCR,技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为,变性,（,denaturation,，）,退火,（,annealing,）、,延伸,（,extension,）三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异,DNA,片段得到大量扩增。,The Invention of PCR,Invented by Kary Mullis in 1983.,First published account appeared in 1985.,Awarded Nobel Prize for Chemistry in 1993.,模板,DNA,：一般,10,2,10,5,个拷贝,Mg,2,：,Mg,2,能影响反应的特异性和扩增片段的产率。一般反应体系中,1.5-2.5 mmol/L,反应反冲液：使,Taq DNA,聚合酶的作用环境维持偏碱性。,dNTP,：在,PCR,反应体系中其浓度一般为,20,200,mol/L,，浓度过高、过低都不利。,Taq DNA,聚合酶：在,70,75,C,具最高活性。具有,5,3,的聚合酶活性和,5,3,的外切酶活性，无校正功能。是镁依赖性酶。,引物：,PCR,反应中引物浓度一般为,0.1,0.5,mol/L,。,PCR,反应体系中的主要成分及其作用：,变性：,模板,DNA,由双链变成单链，使有利于与引物结合。可根据模板的复杂程度调整变性温度和时间，一般情况下,94,C 30,秒可使各种复杂的,DNA,分子完全变性,（过高的温度或高温持续时间过长，可对,Taq DNA,聚合酶活性和,dNTP,分子造成损害）。,退火：,变性的,DNA,快速冷却至,40,60,C,可使引物和模板,DNA,发生结合。可根据引物的长度和,G,C,的含量选择复性温度。退火时间,30,秒。,延伸：,一般是,70,75,C,，此时,Taq DNA,聚合酶活性最高。,1kb,的可适当延长时间。,循环次数：,理论上,20,25,个循环,PCR,产物的累计即可达到最大值、实际操作中,25,30,较合理。循环次数越多，非特异性产物的量也会增加。,循环条件的设定：,Thermal Cyclers,PCR machine available from many suppliers.,Many block formats and multi-block systems.,Reactions in tubes or 96-well micro-titre plates.,在冰上配制下列反应体系,:,First strand cDNA 2,l,TaKaRa Ex Taq(5 u/1,l)0.5,l,10 Ex Taq buffer2,l,dNTP mixture(2 mM)2,l,Primer F(10 mM)0.5,l,Primer R(10 mM)0.5,l,ddH,2,O12.5,l,混匀后，短暂离心，每管加一滴矿物油。,操作步骤（三）,PCR,PCR,反应循环条件设置：,根据引物及基因的表达水平设置循环参数：如引物序列、引物长度、扩增片段的长度及,mRNA,的丰度等,检测：加,2,l,溴酚蓝，混匀，取,15,l,反应产物电泳；,在,1%,的琼脂糖凝胶上点样电泳；,EB,染色，紫外观察。,引物序列,引物名称,引物序列,扩增片段大小,GUS F,CCAGGCAGTTTTAACGATCAGTTCGC,1573bp,GUS R,GAGTGAAGATCCCTTTCTTGTTACC,GAPDH_F1,CGACCCGTTCATCACCACCGAC,基因组,1444bp,cDNA 515bp,GAPDH_R1,AGCTAGCAGCCCTTCCACCTCTCCA,GUSF-1,GGtgattgatgaaactgctgctgTCG,554bp,GUSR-1,acatatccagccatgcacactGATAC,-actinF,TGCTATGTACGTCGCCATCCAG,基因组,750bp,，,cDNA 250bp,-actinR,AATGAGTAACCACGCTCCGTCA,反应程序：,94,度,45,秒，,58,度,45,秒，,72,度,60,秒，,27 CYCLES.,Genome:750 bp,cDNA:250 bp,2KB cDNA ZH11 H2O,-actin,本次,RT-PCR,实验使用的引物：,报告基因GUS,组成型基因：,GAPDH,Taq,酶过多；,Mg,2+,浓度不合适；,引物浓度过高或设计不合理；,复性温度过低；,循环次数过多；,模板量过多；,PCR,产物的电泳检测时出现拖带或非特异性扩增带的可能原因：,PCR,扩增产物电泳检测,Optimising the Annealing Temperature,Primers have a calculated annealing temperature(,e.g.,54,).,Temperature must be confirmed practically.,Temperature steps of 2,above and belowUse gradient cycler.,Optimising the Mg,2+,Concentration,The fidelity of the PCR depends on Mg,2+,.,Optimize Mg,2+,in a ladder of 0.5 mM.,Sometimes a compromise between yield and specificity.,引物问题,引物浓度过高：与模板错配，非特异扩增；产生引物二聚体,引物长度：一般,18,28 bp,；,GC,含量约,50,60,配对引物的,Tm,值要相当,引物,3,端应尽量避免互补，以免产生引物二聚体,引物,3,端,3,个或,3,个以上的,GC,，容易结合到基因组,GC,丰富区域，导致错误扩增,点样或染胶问题,反应体系中忘记加入某种成分,(,无扩增产物）或分装,mixture,时出了问题；,目的片段太大，使用的,DNA Polymerase,无法扩增出目的片段；,DNA,溶液中或反应体系中含有,Taq,酶抑制剂，抑制了,Taq DNA,聚合酶的活性。,退火温度太高；,Taq,酶活力不够或其他试剂有问题；,引物设计不合理，与模板不配对等。,导致,PCR,产物很少或无扩增产物的原因,凝胶电泳检测,PCR,产物时，目的扩增带很弱或看不到目的扩增带，应从以下几个方面寻找原因：,