苯酚降解菌的分离.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,湖水污泥微生物,中苯酚降解菌的分离与特性测定,实验意义,苯酚,是染料、农药、医药等行业的重要生产原料和中间体,是工业废水中的常见污染物之一,。,由于它具有较强的,生物毒性,许多国家已将其列入重点污染物名单之中,并且采取各种措施来消除环境中的苯酚污染,。而且它的水体污染很,难,去除。,所以,在这些措施中,生物修复是一种低成本的环境友好型污染消除方式,它的关键是获得具有苯酚降解功能的微生物,。,实验目的,掌握从土壤中分离苯酚降解菌的方法,掌握梯度平板法分离纯化细菌,的方法,掌握革兰染色的方法,实验原理,取湖水污泥，在黑暗环境下的细菌,富集,，将细菌在不断增加苯酚浓度的培养液中,培养,，得到苯酚耐受菌或者降解菌。,分离,出细菌，在苯酚培养液中培养进行4-氨基安替比林分光光度法,测定,，比较苯酚的前后含量确定其是不是降解菌。,特性测定本实验只做革兰染色,具体细菌种属的鉴定通过,核酸,进行,实验材料,1、,耐酚,培养基(g/L):酵母膏5.00,g,蛋白胨10.00,g,NaCl10.00,g，蒸馏水1L，PH7.0,琼脂16g，121灭菌20min。,2、,苯酚无机盐培养(PMM,g/L):NH,3,NO,3,1.00,KH,2,PO,4,1.50,K HPO,4,0.50,NaCl0.50,MgSO,4,7H,2,O 0.10,pH7.07.2,苯酚作为碳源,浓度根据需要添加,固体培养基加2.0%的琼脂.,实验材料,3,、苯酚培养液：苯酚25-75mg，尿素0.1g，微量元素10ml，蒸馏水90ml，PH7.0-7.2，121灭菌20min。,4,、革兰染色所需试剂,结晶紫、碘液、95%乙醇、复红、香柏油,PH计，温度计，黑布，接种环，酒精灯，显微镜,实验方法,一、,细菌的富集和分离,1、,从,校园小河污泥中,取,污泥，,称取5.00g加到50ml含有25mg/L苯酚的PMM培养基中。,2、,于30,.220r/min摇床5d培养后，分别添加3次,苯酚,无机培养液。,隔3天后第一次添加PMM培养液，使苯酚终浓度分别增加至100mg/l；隔3天后第二次添加PMM培养液，使苯酚终浓度分别增加至200mg/l；第三次隔3天后，添加PMM培养液，使苯酚终浓度分别增加至300mg/l。,3、,最后取培养液进行系列稀释后涂布于苯酚浓度为300mg/L的PMM固体培养基平板上，30培养3d后挑取形态上有差异的单菌落,。,以上所有培养均用黑布遮盖,。,实验方法,2降酚菌的分离纯化：,1、,梯度平板法,制备,梯度平板：12ml不含苯酚的无菌耐酚培养基倾斜于一直径9cm的培养皿中，立即将此培养基协防形成斜面，并刚好遮住底。待凝固后，平放，再加入12ml含苯酚固体培养，完全遮住下层。,稀释涂布,分离,：,样品液稀释：将富集的培养基做10倍系列稀释（至10-3）,实验方法,样品涂液步平板：用无菌1ml移液管分别吸取上述10-3、10-2、10-1和原液依次滴加于相应的平板上，并用无菌涂布棒从平板中央均匀向四周涂布。,细菌培养：30恒温箱培养2,天,降酚菌的纯化：用无菌接种环挑取高浓度区的菌落接种到PMM培养基上，30恒温培养3天,实验方法,3.最优降解苯酚细菌鉴定,革兰染色显微镜下观察,用接种针挑取少许幼龄培养物，涂布在干净玻片上的一滴无菌水中，风干固定。,用结晶紫的混合液染色1-2min后，用水洗。,碘液作用1min，水洗，吸干。,用95%的乙醇溶液脱色，流滴至洗脱液至无色(约30s)。,用复红液复染约2-3min，水洗，风干，用油镜观察。,注意事项,1实验人员必须较为清晰的明白实验方法后才可进行实验,2取污泥最好在水流缓的地方，污泥位置稍微深一点的，细菌才多，机会才打,3用到苯酚时，使用手套、口罩防止中毒。,预期结果,经过几天培养后培养液变浑浊,在涂布分离中能观察到单细胞菌落,革兰染色可能为红色也可能为蓝色,本实验的困难,实验技术不成熟，甚至不会，可能实验结果没有是由于实验技术的原因，所以组员要自己课下学习。,实验的未知性：目前分离的苯酚降解菌都是在苯酚污染的环境中的分离出来的，学校湖中的污泥不确定是否会分离出目的菌。,苯酚的毒性,Thanks,苯酚,苯酚能够凝固蛋白质，具有杀菌效力，来苏儿消毒药水就是苯酚和甲苯酚的肥皂液，用做消毒剂、杀虫剂等。在生产过程中如果不注意防护或由于各种事故，苯酚可造成人体急性中毒。,