蚯蚓纤维蛋白溶解酶的提取分离纯化.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,蚯蚓纤维蛋白溶解酶的提取分离纯化,生物,062,第二组,酶是植物体内具有催化作用的蛋白质，动植物体内的生化反应，一般都是在酶的作用下进行的，没有酶的催化反应，动植物的生命也就停止了，因此对酶的研究是阐明生命现象本质中十分重要的部分。为要研究酶首先要将酶从组织中提取出来，加以分离、纯化，不同的研究目的对酶制剂的纯度要求也不相同，有些工作只需要粗的酶制剂即可，而有些工作则要求较纯的酶制剂，需根据不同情况区别对待。在酶的提取和纯化过程中，自始至终都需要测定酶的活性，通过酶活性的测定以监测酶的去向。,酶的存在位置？,存在于动植物以及微生物的细胞的各个部位,什么是酶的提取与分离纯化？,酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其他含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所需要的酶制品的过程。,酶的粗提液是否只有酶，有没有其它物质？,除含有所需要的酶外，还含有其他蛋白质，以及其他大分子和小分子化合物杂质。因此需要根据提取酶与杂质的性质差别进行分离纯化。,如何将酶从粗提液中分离纯化？,要在许多蛋白质的混合物中分离出所需要的酶蛋白，目前常用的方法有盐析法（利用不同蛋白质在不同盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离），柱层析法，薄膜超滤法，亲和层析法，电泳法等。在大体积的提取液中一般先采用硫酸铵分级盐析沉淀。盐析法是提纯酶使用最早的方法之一，迄今仍广泛使用，而且在高浓度的盐溶液中酶蛋白不易变性而失去活性，利于工作在室温中进行。不同蛋白质在高浓度的盐溶液中溶解度有不同程度的降低，盐析法就是利用这一性质，将不同性质的蛋白质分离，选择合适饱和度的硫酸铵，使沉淀的蛋白质的酶活性最大。,沉淀的蛋白质经离心后收集之，再溶于少量缓冲溶液中，经透析或凝胶柱过滤，以除去硫酸铵及其他小分子杂质，然后再经过柱层析分离。由于吸附剂的不同，又有吸附柱层析、离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析等。对于不同的支持物采用的洗脱方法也不同，分子筛类型凝胶过滤柱层析，洗脱液只要用一定浓度的缓冲液就可以了，亦即等浓度洗脱。对于吸附柱和离子交换柱层析，往往要采用浓度梯度溶液进行洗脱，最方便的是线性梯度浓度，当然用非线性梯度会得到更好的分离效果。柱层析一般都需要自动收集仪，如果能配用蛋白质检测仪就更好了。目前柱层析和硫酸铵分级沉淀一样，已经成为一种常规的酶的分离提纯的步骤之一了,近年来纯化酶常用的一种有效方法为亲和层析。主要利用酶和底物、抑制剂或辅酶具有一定的结合能力，这一性质即可用来分离、提纯酶。首先选择一支持物，如琼脂（,Sepharose,）将底物、竞争性抑制剂或辅酶，以共价键的形式连接到支持物上，然后把含有酶的溶液，流过装有专一性底物、竞争抑制剂或辅酶的层析柱，酶即被保留在支持物上，再经过充分洗涤除去未被吸附的杂质，然后用含有一定浓度的底物或竞争性抑制剂或辅酶的缓冲液，进行竞争性洗脱。如果亲和剂选择合适，往往能得到较高纯度的酶，是酶分离、纯化中既方便又最有效的一种方法。,蚯蚓,俗称地龙,在我国入药已有几千年的历史。地龙为环节动物门钜蚓科动物参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓或栉肓毛蚓的干燥体。前一种习称“广地龙”,后三种习称“泸地龙”,主产于广西、广东、福建。性寒,味咸。清热定惊,通络、平喘,利尿,;,用于高热神昏惊痫抽搐,关节麻痹,肢体麻木,半身不遂,肺热喘咳,尿少水肿,高血压症。地龙是我国重要的中药材之一。最早的中药学专著,神农本草经,中收载的6 7,种动物药中就有蚯蚓。李时珍著,本草纲目,虫部,4 2,卷中用蚯蚓入药的处方有,4 0,多种。,蚯蚓中含有蚯蚓素,酶,维生素等多种营养成分,具降压平喘,解热,利尿通络,抗过敏,解毒生肌,溶栓纤维及抗凝血等药理作用。自,1983,年日本宫崎医科大学美源恒极道、从蚯蚓中提取了具有较高活性的纤溶酶以来,国内外纷纷研究此酶,大量实验证明,该药在动物实验中口服及注射均有抗栓溶栓作用。,蚯蚓构造图,蚯蚓纤维蛋白溶解酶的提取,将蚯蚓放在水组织捣碎机捣碎匀浆,放入离心机进行离心,取出上清液,加人丙酮产生沉淀,再加人乙醚脱水,即得粗品。,纤溶酶活检测方法,采用纤维蛋白法侧纤溶活性,制板按,Astrup,法。以尿激酶为标准蛋白,以直径为,5mm,滤纸片为样品载体,点样,6ul,35,一,37,度保存,测溶圈面积,以不同单位尿激酶的溶圈面积,以不同单位尿激酶的溶圈面积与单位作标准曲线（,ul,一,mm,）计算样品酶活。,蛋白质纯度的检测,以聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分离胶浓,12.5%,浓缩胶浓度为,4.5%,样品在浓度缩胶内时以,120v,电压电泳,样品进人分离胶后以,250v,电压电泳。,蛋白质浓度的检测,以,752,一型紫外光栅分光光度计测其在,280nm,处光吸收。,1,、将粗酶液过,2,万,d,及,5,万,d,超滤膜。,2,、超滤后各段酶液以上述纤维酶活检测方法中测活力得纤溶酶主活力部分在2,一,5,万,d,之间,3,、将超滤后,2,一,5,万,d,间酶液经浓缩,5,倍后上,G,一,100,柱,以,PH6.5,的磷酸缓冲液洗脱,以,FC,一,95,收集,63,（,4.2ml/,管,8,秒,/,滴,),以,752,紫外光栅分光光度计测,280nm,处吸收情况。,4,、测洗脱液酶活,得其活力部分在第,2,峰酶活曲线。,5,、将,G,一,100,柱洗脱液活力峰合并,加人,DEAE-C52,柱进一步纯化,先以,PBS,洗涤至下柱液,A2800.03,后以,0.5,一,1.4%NaCl-PBS,液梯度洗脱,收集,120,管。,4,秒,/,滴、,3.2ml/,管、以,752,紫外光栅分光光度计测光吸收。,6.,测酶活，找出主峰活力峰，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测此峰得到条带得以分离此蛋白酶。,洗脱电泳将切下的凝胶条分别置于分子截留量为,3,kD,的透析袋中,袋内含,5%,乙酸。透析袋置水平电泳槽内,电极缓冲液为,5%,乙酸,150 V,恒压电泳,90 min,。收集袋内液体,以蒸溜水透析,24 h,冻干后各溶于,0.01%,乙酸中。,谢谢！,