DNS法测定α-淀粉酶活力的方法.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,利用,DNS,法测定,-,淀粉酶活力的方法,目的要求,了解生物学研究中针对糖含量测定的常用方法及相关原理。,掌握一般标准曲线制作的意义及要求。,掌握,DNS,比色法测定,-,淀粉酶活力的原理、方法及操作步骤。,掌握利用,EXCEL,分析工具库数据分析,回归分析，得到回归方程及相关分析结果。,糖的测定方法,大致可分为三类,：,1.,物理法,旋光法,、,折光法,、,比重法,；,2.,物理化学法,点位法,、,极普法,、,光度法,、,色谱法,；,3.,化学方法,斐林氏法,、,高锰酸钾法,、,碘量法,、,铁氰化钾法DNS,比色法、,蒽,酮,比色法,、,咔唑比色法,生物学研究中关于糖测定中常用的方法,菲林试剂滴定,还原糖，常量分析,DNS,比色法,还原糖，微量分析,蒽酮比色法,总糖，微量分析,配制系列浓度稀释液的方法,线性稀释,稀释液的浓度梯度是相同的（,0,，,0.2,，,0.4,，,0.6,，,0.8,，,1.0,）；,对数稀释（倍数稀释）,系列溶液的浓度比是一常数，取决于稀释梯度,2,倍稀释（,1,、,1/2,、,1/4,、,1/8,）；,10,倍稀释（,1,、,1/10,、,1/100,、,1/1000,）；,调和浓度稀释,系列溶液的浓度为连续排列整数的倒数（,1,，,1/2,，,1/3,，1/4,，,1/5,）。,-,淀粉酶酶活力测定的原理,底物（反应物）为淀粉,碘比色法（反应一定量淀粉为糊精的时间）,产物为麦芽糖、糊精等,麦芽糖为还原糖，可以用测定还原糖的方法来测定其生成量（如,DNS,法），从而计算出酶活力单位。,DNS,试剂测定还原糖的原理,淀粉酶催化产生的还原糖（麦芽糖等）能使,3,5-,二硝基水杨酸还原，生成棕红色的,3-,氨基,-5-,硝基水杨酸，其反应如下：,淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位样品（重量或体积）在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。,酶活力测定（,DNS,比色法）,酶活力定义：在一定反应条件下（本实验为,40,，,pH5.6,或,6.0,），,1,分钟反应生成,1mg,麦芽糖的酶量定义为,1,个酶活力单位。,注意：,去除,-,淀粉酶的干扰（,-,淀粉酶不热耐，在,7015min,钝化）,植物材料来源需要注意。本此实验中忽略不计。,检测的原理：,酶解的产物之一,麦芽糖具有还原性，可以使试剂中的,3,，,5-,二硝基水杨酸还原，形成红色的物质，在,540nm,下有吸收峰，并和浓度呈一定线性关系。,计算公式：根据标准曲线计算。,3,，,5-,二硝基水杨酸（,DNS,）试剂配制说明,21g,氢氧化钠（先加入溶解）；,182g,酒石酸钾钠（同上）6.3g DNS,（,3,，,5-,二硝基水杨酸），加热完全溶于上述溶液中；,5g,重蒸苯酚（冷却后加入）；,5g,无水亚硫酸钠（冷却后加入）；,完全溶解后定容至,1000ml,，贮存时间越长越稳定。,引自：朱俭，曹凯鸣，周润琦，蔡武城，袁厚积编著生物化学实验上海：上海科学技术出版社，,1981,标准曲线法,取标准品配成一系列已知浓度的标准溶液，在选定波长处（通常为,max,），用同样厚度的吸收池分别测定其吸光度，以吸光度（,OD,）为纵坐标，系列标准溶液浓度为横坐标作图，得到一通过坐标原点的直线标准曲线（工作曲线）。,理想的标准曲线满足以下条件：,1,、至少,5,个点，一般不超过,7,个点；,2,、,2,个以上重复值；,3,、重复值误差小于,5%,；,4,、点与线的垂直距总和最小；,注意：,标准曲线不能任意延长！（有一定测定范围）,理想标准曲线的特点,过原点的直线；,斜率为,1,（,45,）,；,浓度为待测物质浓度的一半二倍；,OD,值在,0.05,0.8,之间（最好控制在,0.2,0.6,）。,mg/ml,麦芽糖标准曲线的制作,取,6,支干净的具塞刻度,25mL,比色管，编号，按下表中加入相关试剂；,混匀后，置沸水浴中煮沸,5min,。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至,25mL,。以,1,号管作为空白调零点，在,540nm,波长下比色测定光密度。以麦芽糖含量（,mg,）为横坐标，吸光度（,OD,）为纵坐标，绘制标准曲线。,沸水浴时不要加塞！,利用,Excel,中相关统计分析工具，完成回归方程的计算及分析，并绘制标准曲线图。,相关试剂（第一种）,标准麦芽糖溶液（,1mg/mL,）：,精确称取,1g,麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至,1000mL,。,0.1mol/L pH5.6,的柠檬酸缓冲液：,称取柠檬酸（,C,6,H,8,O,7,H,2,O,）,5.78g,，柠檬酸钠（,Na,3,C,6,H,5,O,7,2H,2,O,）,21.32g,，用蒸馏水溶解并定容至,1000mL,。,1%,马铃薯淀粉溶液：,称取,1g,马铃薯淀粉（,105,烘干,2hr,）溶于,100mL0.1mol/L pH5.6,的柠檬酸缓冲液中,（一般需要密封,121.3,灭菌处理,20min,）。,相关试剂（第二种）,标准麦芽糖溶液（,1mg/mL,）：,精确称取,1g,麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至,1000mL,。,0.2mol/L pH6.0,磷酸氢二钠,-,柠檬酸缓冲液：,称取磷酸氢二钠（,Na,2,HPO,4,.12H,2,O,）,45.3g,，柠檬酸（,C,6,H,8,O,7,H,2,O,）,7.74g,，先在烧杯中用蒸馏水使之溶解，然后转入容量瓶中定容至,1000mL,。,1%,马铃薯淀粉溶液：,称取,1g,马铃薯淀粉（,105,烘干,2hr,）溶于,100mL,0.2mol/L pH6.0,磷酸氢二钠,-,柠檬酸缓冲液中,（一般需要密封,121.3,灭菌处理,20min,）。用时注意酶污染。,标准曲线制作相关试剂加入表,试 剂,管 号,1,2,3,4,5,6,标准麦芽糖溶液,（,mL,）,0,0.4,0.8,1.2,1.6,2.0,蒸馏水,（,mL,）,2.0,1.6,1.2,0.8,0.4,0,麦芽糖含量,（,mg,）,0,0.4,0.8,1.2,1.6,2.0,DNS,试剂,（,mL,）,2.0,2.0,2.0,2.0,2.0,2.0,加入完成混匀后沸水浴,5min,，定容至,25mL,混匀比色。,预留发酵液酶活力测定,需要稀释倍数,10,、,100,、1000,、,10000,、,50000,对照设置,1,个就可以，,10,或,100,倍；,按照,DNS,方法测定。,酶活力测定步骤（流程）,1ml,稀释酶液,40,水浴保温,5min,加入,2.0mlDNS,1ml,稀释酶液,40,水浴保温,10min,加入,2.0mlDNS,40,水浴保温,10min,沸水浴,5min,沸水浴,5min,冷却定容至,25ml,冷却定容至,25ml,540nm,比色测定,OD,值,540nm,作比色调“,0,”、“,100,”用,加入,1.0ml1%,淀粉溶液,（预先,40,水浴保温,5min,）,加入,1.0ml1%,淀粉溶液,（预先,40,水浴保温,5min,）,40,水浴保温,5min,代入回归方程计算出麦芽糖生成量,计算公式,N-,酶液稀释倍数,10-,反应时间为,10min,注意：标准曲线、酶活力比色测定时使用玻璃比色皿（可见光比色）,酶活力定义：,在一定反应条件下（本实验为,40,，,pH5.6,或,6.0,），,1,分钟反应生成,1mg,麦芽糖的酶量定义为,1,个酶活力单位。,预留发酵液紫外分光光度法测定蛋白质含量的稀释要求,酶溶化后稀释至,50,100,倍测定,A280,和,A260,；以蒸馏水为对照。,代入,Lowry-,Kalckar,经验公式：,蛋白质含量（,mg/,mL,）,=（1.45A,280,0.74A,260,）N,注意：,使用,石英比色皿,测定（紫外光比色用？），石英比色皿较贵，损坏要赔偿！,比酶活力计算,定义：,1mg,蛋白质的酶活力单位。,计算公式：,说明：,样品测定得到酶活力单位（,U/,mL,）和蛋白质含量（,mg/,mL,）。,可以反映样品中酶的纯度。,分光光度计介绍,原理：在一定条件下，遵循朗伯比尔（,Lambert-Beer,）定律,组成：光源、单色器（棱镜、光栅）、吸收池、检测器（光电管、光电倍增管、光电二极管阵列）、显示系统,光源,单色器,吸收池,检测器,显示系统,朗伯比尔定律,朗伯,-,比尔定律,b,I,0,I,透光度,T,：,吸光度,A,：,I,0,：入射光强度,I,：透过光强度,L,ambert,J H,1760,B,eer,A,1852,定义,光吸收基本定律,（郎伯,-,比尔定律）,朗伯比尔定律,朗伯,-,比尔定律,郎伯,-,比尔定律,表达式,A,：吸光度；对光的吸收程度,b,：液层厚度，单位,cm,c,：溶液的浓度，,molL,-,：摩尔吸收系数，,Lmol,-,cm,-,如果,c,单位：,gL,-,则吸收系数为,a,，,单位：,Lg,-,cm,-,的特点,=f,(,),定律适用单色光,标志灵敏度,