NMR方法解析蛋白质结构.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,NMR,方法解析蛋白质结构,冯银刚,北京核磁共振中心,(,),北京大学化学与分子工程学院,fyg,yingangfeng,2006.4.12,蛋白质结构层次,氨基酸通过肽键形成的生物高分子,一级结构、二级结构、三级结构、四级结构,肽键具有双键性质而不能任意旋转,主链可旋转的二面角,，,20,种常见的氨基酸残基,通常,NMR,中一个自旋系统是指一个氨基酸残基上的所有原子,核磁共振方法解析蛋白质溶液结构,测定原子（氢原子）之间的距离信息和其他约束信息，得到空间,结构模型,化学结构（氨基酸序列，即一级结构）已知，测定空间结构（三级结构，四级结构）,适用范围,分子量,分子量受限：谱峰重叠，分子增大造成横向弛豫时间减少（线宽增加）,同核二维,1,H,谱：,80,氨基酸,异核多维（二维、三维）：,常规三共振（,1,H,15,N,13,C,）,200,氨基酸,氘标记，特殊标记 已报道有,700,氨基酸,同核样品可以是天然提取、化学合成或分子生物学方法培养制备,标记样品通常只能通过分子生物学方法培养制备,常规样品,浓度：毫摩尔每升,500uL 10kDa 5,毫克每样品,均一,没有聚合,水溶液（,10%,重水锁场）,pH98%,1,H-,15,N HSQC,上所有谱峰得到了指认,J.,Biomol,.NMR 2005,31:263-264,BMRB 6410,,www.bmrb.wisc.edu,由化学位移得到二级结构的信息,二级结构,CSI,：化学位移与无规卷曲的多肽化学位移之差,TALOS,：基于数据库比对预测二面角,可用于结构计算和分析,结构计算,基本方法,由实验得到各种构象约束信息：距离，二面角,约束信息是不完备的,约束信息是不精确的,计算满足这些约束条件的构象,距离几何,(Distance Geometry),约束条件下的分子动力学模拟,(Restrained Molecular Dynamics Simulation),约束信息,距离约束,1,H-,1,H NOE,氢键,二面角约束,主链侧链,肽键：反式顺式,其他,手性,L-,氨基酸,约束生成,NOE,指认,Unique,：只有一种可能,Ambiguous,：有多种可能,转化为距离,实验通常可检测,5,距离是不精确的：距离范围,距离是大量的,精确结构,其中一种可能是正确的,多种可能都是正确的（谱峰重叠）,二面角约束,a,-helix:,f,=-100 to-20,y,=-70 to-10,b,-sheet:,f,=-180 to-60,y,=20 to 180,二面角,预测：,CSI,或,TALOS,实验：,HNHA,HNHB,等,对特定的二级结构有一定的分布,拉氏图,(,Ramachandran,plot),最佳区,次佳区一般区,不允许区,二面角约束,二级结构判断：特征的,NOE,信号,氢键约束,-Helix,Parallel,-Strands,Anti-parallel,-Strands,H-O 2.0,N-O 3.0,N-H-O,根据二级结构或实验判断氢键,分子动力学模拟（结构计算）,模拟分子随机运动，使其达到能量的最小值,约束条件转化为,MD,中的能量项,V,total,=,V,bond,+,V,angle,+,V,dihedr,+,V,vdw,+,V,coulomb,+,V,NMR,模拟退火：克服局部的能量最小点,计算多个结构，取能量较低的若干结构作为结果,Ensemble(NMR,信息的不完备和不精确,),K,NOE,(,r,ij,-r,ij,1,),2,if,r,ij,r,ij,u,0 if,r,ij,l,r,ij,90%,）,SANE,依赖初始结构的自动,NOE,指认,Grx-C1,的结构计算,CYANA,结构初步优化,力场相对简单,运行速度快,无需初始结构,结构相对较为粗略,Amber,结构精修,具有更精细的力场参数，使用溶剂化模型（或显式加溶剂）从而获得更加合理的局部构象,需要整体折叠正确的初始结构,运算量大，速度慢,Grx-C1,的结构计算,CANDID/CYANA,得到初始结构（全自动）,2 CPU,8,小时,SANE-CYANA,循环，进行初步优化（半自动）,手工分析违约和未指认的,NOE,每个循环,2CPU,1,小时,20-40,个循环,SANE-AMBER,循环，进行结构精修（半自动）,每个循环,20 CPU,15,小时,1030,个循环,结构计算结果,PDB 1Z7P(ensemble),1Z7R(mean),,www.rcsb.org/pdb,结构计算结果,约束统计,NOE,：,4845,二面角：,160,氢键：,47,手性：,287,违约状况,距离 无,0.2,二面角 无,结构计算结果,结构评价,Most favored regions(%),88.8,Additionally allowed regions(%),10.7,Generously allowed regions(%),0.5,Disallowed regions(%),0.0,RMSD,All residues,Regular secondary structure,Backbone heavy atoms,0.88,0.32,All heavy atoms,1.13,0.68,三共振方法所需时间,提取样品,2,4,周,数据采集,4,8,周,数据处理,1,4,小时每实验,共振指认,2,4,周,结构计算,2,4,周,数据处理通常在数据采集后立即进行，在总时间中可忽略不计,数据采集与共振指认的时间可部分重叠,一些其他因素,水峰压制,小分子干扰,对异核实验影响不大,温度：控温装置分辨率、信噪比与时间,分辨率：间接维点数,实验时间与间接维点数成正比,信噪比与累加次数的平方根成正比,实验时间与累加次数成正比,最新的进展,谱仪：超低温探头,提高灵敏度,2,4,倍,TROSY,（横向弛豫优化谱）,在,700MHz,以上高场谱仪中可以显著减小线宽，从而可用于测定更大分子量的蛋白质,RDC,（残余偶极耦合）,得到化学键的空间相对取向信息,自动化方法,显著加速结构计算进程,使用的软件,NMRPipe,数据处理,,spin.niddk.nih.gov/bax/software/NMRPipe,/,NMRView,指认分析,,Euro,,www.las.jp/prod/cyana/eg,/,TALOS,基于化学位移预测主链二面角,(,NMRPipe,的一部分,),,spin.niddk.nih.gov/NMRPipe/talos,/,SANE,基于结构的,NOE,自动指认,J,Biomol,NMR,2001,19(4),321-9,Amber,分子动力学模拟。用于结构优化,$400,,amber.scripps.edu,/,PROCHECK-NMR,结构分析与评价,www.biochem.ucl.ac.uk/roman/procheck_nmr/procheck_nmr.html,MOLMOL,结构分析与绘图,,hugin.ethz.ch/wuthrich/software/molmol,/,其他软件,数据处理,Felix$?,,(Free?),,guentert.gsc.riken.go.jp/Software/Prosa.html,指认分析,Felix$?,,$200,hugin.ethz.ch/wuthrich/software/xeasy/index.html,Sparky,Free,,www.cgl.ucsf.edu/home/sparky,/,CARA,Free,,www.nmr.ch,结构计算,CNS,Free,,cns.csb.yale.edu,/,XPLOR,Free,,xplor.csb.yale.edu/xplor,/,XPLOR-NIHFree,nmr.cit.nih.gov/xplor-nih,/,分子绘图,PyMol,Free,,/,MolScript,Free,,www.avatar.se/molscript,/,RasMol,Free,,www.openrasmol.org,/,VMD,Free,,www.ks.uiuc.edu/Research/vmd,/,NMR,结构解析流程,生物信息学和生物化学分析,样品制备（蛋白质表达纯化，标记）,核磁共振数据收集,化学位移指认,NOE,指认,结构计算,核磁共振初步鉴定,二级结构分析,参考书,NMR of Proteins and Nucleic Acids,Wuthrich,K.,Wiley Press,1986,NMR of Macromolecules,Roberts J.,Oxford University Press,1993,Protein NMR Techniques,Ed.David G.Reid,Humana Press,1997(Methods in Molecular Biology,V60),蛋白质分子的溶液三维结构测定,多维核磁共振方法,，华庆新，湖南师范大学出版社，,1995,现代核磁共振实用技术及应用,，毛希安著，科学技术文献出版社，,1999,生物大分子多维核磁共振,，夏佑林等，中国科学技术大学出版社,1999,Thank You!,