蛋白质表达纯化概述.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,蛋白质表达与纯化概述,第一章：蛋白质,定义：定义1：生物体中广泛存在的一类生物大分子，由核酸编码的氨基酸之间通过氨基和羧基形成的肽键连接而成的肽链，经翻译后加工而生成的具有特定立体结构的、有活性的大分子。,蛋白质按实验室研究分类（其它分类方法不做赘述）,1.天然蛋白,2.重组蛋白,1.1.天然蛋白,定义：,存在于自然有机生命体的蛋白质的总称,由于分离纯化工艺繁琐、得率低、难以分离鉴定、成本高等缺陷。基本已经脱离实验室研究，但是在对某蛋白的实验室研究的特定阶段必须分离得到天然蛋白方能进行实验研究，同样某些以天然蛋白为中间产物或生产产品的公司会进行天然蛋白的分离纯化（如化妆品、护肤养生保健品等行业）。,1.2.重组蛋白,定义：,通过重组DNA(或RNA)技术获得的蛋白质。,重组蛋白已经广泛应用于实验室研究、蛋白内产品、药物筛选、食品卫生等领域。,第二章 蛋白表达系统,蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系。通过这个体系可以实现外源基因在宿主中表达的目的。一般由以下几个部分组成：,1,、,宿主。,表达蛋白的生物体。可以为细菌、酵母、植物细胞、动物细胞等。由于各种生物的特性不同，适合表达蛋白的种类也不相同。,2,、,载体。,载体的种类与宿主相匹配。根据宿主不同，分为原核（细菌）表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达载体等。载体中含有外源基因片段。通过载体介导，外源基因可以在宿主中表达。,3,、辅助成分,。帮助重组蛋白表达、修饰、提高稳定性和溶解性的辅助片段等。有的表达系统中还包括了协助载体进入宿主的辅助成分。比如昆虫,-,杆状病毒表达体系中的杆状病毒。,蛋白质表达有五大表达系统：,1.原核表达系统,2.酵母表达系统,3.昆虫表达系统,4.哺乳表达系统,5.植物表达系统,2.1.原核表达系统,常用原核表达系统为重组大肠杆菌（E.coli）,在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是大肠杆菌表达系统，也是目前掌握最为成熟的表达系统，大肠杆菌表达系统以其细胞繁殖快速产量高、,IPTG,诱导表达相对简便等优点成为生产重组蛋白的最常用的系统。,对于表达不同的蛋白，需要采用不同的载体。目前已知的大肠杆菌的表达载体可分为非融合型表达载体和融合型表达载体两种。非融合表达是将外源基因插到表达载体强启动子和有效核糖体结合位点序列下游，以外源基因,mRNA,的,AUG,为起始翻译，表达产物在序列上与天然的目的蛋白一致。融合表达是将目的蛋白或多肽与另一个蛋白质或多肽片段的,DNA,序列融合并在菌体内表达。融合型表达的载体包括分泌表达载体、带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣的表达载体。,原核表达系统的优缺点,1,原核蛋白表达系统既是最常用的表达系统，也是最经济实惠的蛋白表达系统。,代表：,大肠杆菌表达系统。,优点：,遗传背景清楚、成本低、表达量高和表达产物分离纯化相对简单,缺点：,蛋白质翻译后缺乏加工机制，如二硫键的形成、蛋白糖基化和正确折叠，得到具有生物活性的蛋白的几率较小。,2.2酵母表达系统,酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统，由于兼具原核以及真核表达系统的优点，正在基因工程领域中得到日益广泛的应用，应用此系统可高水平表达蛋白，且具有翻译后修饰功能，故被认可为一种表达大规模蛋白的强有力的工具。,常用的酵母表达系统：,一，酿酒酵母,(Saccharomycescerevisiae),表达系统,二，甲醇营养型酵母表达系统,酵母表达系统的优缺点,代表：,甲醇毕赤酵母,优点：,表达量高，可诱导，糖基化机制接近高等真核生物，分泌蛋白易纯化，易实现高密发酵,缺点：,部分蛋白产物易降解，表达量不可控,2.3 昆虫表达系统,昆虫表达系统是一类应用广泛的真核表达系统，它具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修饰加工以及转移外源蛋白的能力。昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达系统。利用杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载体，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表达。它具有真核表达系统的翻译后加工功能，如二硫键的形成、糖基化及磷酸化等，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白；其最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的,50%,；可表达非常大的外源性基因,(,一,200kD),；具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个外源基因的能力；对脊椎动物是安全的。由于病毒多角体蛋白在病毒总蛋白中的含量非常高，至今已有很多外源基因在此蛋白的强大启动子作用下获得高效表达。常用的杆状病毒包括苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒,(AcNPV),和家蚕型多角体病毒,(BmNPV),，常用的宿主细胞则来源于草地夜蛾,Sf9,细胞，用于表达外源基因的质粒来源于,PUC,系列，其含有一个多克隆位点和多角体蛋白启动子。,昆虫表达系统的优缺点,1,，组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配,2,，蛋白翻译后的加工修饰；,3,表达水平高，可达总蛋白量的,50%,；,4,，可容纳大分子的插入片段；,5,，能同时表达多个基因。主要缺点是外源蛋白表达处于极晚期病毒启动子的调控之下，这时由于病毒感染，细胞开始死亡。,2.4哺乳表达系统,哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时间，而利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几天内使外源基因整合到病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出目的蛋白。哺乳动物细胞表达载体必须包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等控制元件。,根据目的蛋白表达的时空差异，可将表达系统分为瞬时、稳定和诱导表达系统。瞬时表达系统是指宿主细胞在导入表达载体后不经选择培养，载体,DNA,随细胞分裂而逐渐丢失，目的蛋白的表达时限短暂；瞬时表达系统的优点是简捷，实验周期短。稳定表达系统是指载体进入宿主细胞并经选择培养，载体,DNA,稳定存在于细胞内，目的蛋白的表达持久、稳定。由于需抗性选择甚至加压扩增等步骤，稳定表达相对耗时耗力。诱导表达系统是指目的基因的转录受外源小分子诱导后才得以开放。采用异源启动子、增强子和可扩增的遗传标记，可提高蛋白产量。,哺乳表达系统的优缺点,优点：,蛋白翻译后加工机制最接近体内的天然形式，最容易保留生物活性。,缺点：,表达量通常较低，稳定细胞系建立技术难度大，生产成本高。,2.5植物表达系统,植物能够表达来自动物、细菌、病毒以及植物本身的蛋白质易于大规模培养和生产，且在基因表达与修饰及安全性方面有特别的优势，因此利用植物生产外源蛋白质的研究展现了极其诱人的前景。多种抗体、酶、激紊、血浆蛋白和疫苗等都已通过基因工程的手段在植物的叶、茎、根、果实、种子以及植物细胞和器官中得到表达。,如今已经广泛应用于转基因食品、工业生产、护肤保健医药等领域。,植物表达系统的优缺点,优点：,蛋白翻译后加工本身就在植物组织，几乎完整保持蛋白的天然构象，完全保留生物学活性，生物安全性高。,缺点：,分离纯化难度高，培养周期长，,生产成本高。,第三章：融合蛋白在原核表达系统的表达纯化,融合蛋白即在蛋白序列的基础上添加一段人工片段。我们常说的His tag、GST tag即为常用的人工片段，又称作亲和标签。（当然还有抗原抗体标签、金属螯合标签等等）,特点：易纯化、易检测、表达量高、纯度高。,缺点：人工片段会影响蛋白的空间结构，进而影响蛋白的性质、功能。,融合蛋白的简易表达步骤,1.分子克隆构建载体-转化到相应的大肠杆菌工程菌株里-筛选出阳性克隆。,2.预实验：大肠杆菌小量培养检测是否有蛋白表达。,3.蛋白表达：控制IPTG、降温OD、诱导OD（大肠杆菌浓度）、培养时间。,4.蛋白多为胞内表达，即蛋白表达后在细胞体内，不分泌到培养液中。我们只需收获大肠杆菌，做蛋白表达的WB、SDS-PAGE等鉴定。,亲和标签蛋白的简易纯化步骤,1.细胞破碎溶解，利用各种层析介质进行粗纯化。（没有固定的纯化模式，要根据蛋白的各种性质以及所携带的标签进行实验设计）,2.切除标签：利用相应的限制性酶作用于蛋白的酶切位点进行人工标签的切除。,3.提高纯度：二次亲和/金属螯合层析，再附加离子交换、排阻层析等层析手段进一步提高纯度。,4.富集保存：蛋白纯度、蛋白总量达到客户要求后对蛋白进行浓缩，以达到客户要求的浓度。,服务流程,1.客户提供：基因号1、序列,2,、模版,3,、质粒,4,、甘油种4中的哪些？,2.客户的要求：,2.1客户要求同一宿主细胞中,单一蛋白表达,还是,多蛋白共表达,（共表达需要了解多个蛋白片段整合到同一载体还是不同载体）。,2.1是否需要,蛋白标签,GST（常用，增加蛋白溶解性）、His（最常用，用于易表达纯化，性质稳定的蛋白）、Strep（有I、II两种!实验方法不同。）、Flag（Flag是一种抗体，特异性高，表达量相对较低，常用于昆虫、哺乳动物细胞的表达）等,2.2 如果有标签，是在3端还是在5端（或者是蛋白标签在N端还是C端）。需不需要,酶切位点,（用于后续纯化中去除标签）。是否要进行基因突变，,突变位点,在哪里？,2.3 采用什么培养基进行表达？LB,TB,SOB,SOC等等。,2.4,客户,是否有Protocol、essay,等参考文献,客户,是否指定用某种纯化工艺,：亲和层析、排阻层析、反向层析、疏水层析、离子交,换,2.5 表达前是否要做小量实验（预表达/预实验/小试）。是否要做表达条件的优化筛选？如果有，需要做温度、IPTG浓度、诱导OD、抗生素浓度（不常用）、诱导时间中的哪些优化筛选。,2.3,蛋白纯度要求、浓度要求,（蛋白定量方法:分光光度法、旋光光度法等）、蛋白总量要求。是否要去热源（又叫内毒素，常用于抗原抗体的制备以及药物的筛选。）是否要去除RNA，是否要去除核酸，是否要去除DNA。,2.4,蛋白活性要求,（如果用于抗体的制备可以不需要活性。）,2.6 蛋白WB检测：常用于真核细胞表达检测。,Thats all,thinks!,