第六讲 DNA的提取原理及提取技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,DNA,的提取原理及提取技术,天然,DNA,的来源：,1,染色体,DNA,原核生物和真核生物均含有染色体,DNA,它是分离目的基因和基因表达调控因子的主要材料。,2,病毒和噬菌体,DNA,主要用于构建基因克隆载体，也可作为分离目的基因和基因表达调控因子的材料。,3,质粒,DNA,很多微生物,（大肠杆菌、农杆菌和蓝细菌）,都含有质粒,DNA,，主要用于构建基因克隆载体，也可作为分离目的基因和基因表达调控因子的材料。,4,线粒体和叶绿体,DNA,这是真核生物特有的,染色体外遗传物质,，分别含有与呼吸作用和光和作用相关的基因。主要用于分离目的基因。,植物细胞的化学成分主要有,:,1,水、糖类、蛋白质、脂肪以及核酸是生物体所需的基本成分；,2,氨基酸是合成蛋白质的基本原料；,3,果胶、纤维素、半纤维素是植物细胞壁的组成成分；,4,淀粉是光合作用的产物；,5,金属离子主要用来调节细胞的渗透平衡等，比如钾和钠，镁和锰是叶绿素的成分。,植物总,DNA,提取原则,保证,DNA,结构的完整性,排除有机溶剂和金属离子的污染,蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度,排除其他核酸分子的污染,植物,DNA,提取的基本原理,DNA,特点：,DNA,是极性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。,在酸性溶液中，,DNA,易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。,DNP,在盐溶液中的溶解度随着盐浓度的增加而增加。,植物,DNA,提取的基本原理,DNA,提取基本步骤：,1,细胞裂解和,DNA,的溶解,主要任务：,破碎细胞并对,DNA,实施保护。,采取措施：,利用液氮研磨，使酶失活；,快速加入缓冲液并迅速混匀，对细胞溶浆中,DNA,进行保护。,EDTA,螯合,DNA,酶的辅助因子,Mg2+,和,Ca2+,使,DNA,酶活性降低；,SDS,使蛋白质变性并降解蛋白质，也可降低,DNA,酶的活性；,抗氧化剂,降低酚类氧化对,DNA,的干扰；,PVP,与多酚形成复杂的聚合体，与多糖结合，有效去除多糖；,。,植物,DNA,提取的基本原理,2,与核酸结合的蛋白质及,RNA,等杂质的去除；,主要利用,DNA,与蛋白质、多糖等在生化性质上的差别，通过加入离子变性剂，去污剂使蛋白质或多糖变性，核蛋白解聚。,CTAB,十六烷基三甲基溴化铵,SDS,十二烷基磺酸钠,除蛋白质,氯仿,/,异戊醇,抽提,（氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离；异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡）。,使用,变性剂,变性（,SDS,、异硫氰酸胍等）,高盐洗涤,(,当溶液中的中性盐的浓度大于,1mol/L,时，蛋白质会沉淀析出,.),蛋白酶,处理,除多糖,高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入,1/2,体积的,5M,NaCl,，高盐可溶解多糖。,用多糖水解酶将多糖降解。,在提取缓冲液中加一定量的氯苯,(1/2,体积,),，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。,除酚类物质,在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：,-,巯基,乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等,加入易与酚类结合的试剂：如,PVP,、,PEG(,聚乙二醇,),，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与,DNA,的结合,除,各种,离子,70,的乙醇洗涤,注意：,我们在提取某种植物,DNA,时，需要考虑以上各种杂质的存在，根据某种植物,DNA,的具体情况采取相应的去除杂质的方法。,植物,DNA,提取的基本原理,3 DNA,的沉淀和纯化,沉淀,：无水乙醇,TE,缓冲液,(10mmol/L,Tris-HCl,1mM EDTA.pH8.0,）,作用：,TE,中的,EDTA,能螯和,Mg,2+,或,Mn,2+,离子，抑制,DNase,PH,值为,8.0,，可防止,DNA,发生酸解,DNA,的纯化技术,琼脂糖凝胶电泳洗脱法,主要用于小剂量,DNA,的纯化和酶切片段的回收。,1 DNA,样品在琼脂糖凝胶电泳分带后，切取含有待纯化,DNA,带的琼脂糖凝胶电泳块，装入透析袋中；,2,透析袋中加入适量经稀释的电泳缓冲液，并置于稀释的电泳缓冲液中电泳,1-2h,，使,DNA,脱离琼脂糖凝胶；,DNA,的纯化技术,琼脂糖凝胶电泳洗脱法,3,再反向电泳,30s-1min,，使附着在透析袋膜上的,DNA,重新进入缓冲液中；,4,吸取透析袋中的洗脱液置于离心管中，以,10000r/min,离心,5min,转移上清液到另一个离心管中，加入,3M,NaAc,，再加入,2,体积无水乙醇，,-20,放置,1.5min,以上；,DNA,的纯化技术,琼脂糖凝胶电泳洗脱法,5 4,，,12000 r/min,离心,20min,，弃上清，沉淀在空气中晾干，溶于,TE,中，,-20,保存备用。,DNA,提取技术,一、染色体,DNA,的提取,CTAB,法,（,hexadecyltrimethylammonium,bromide,，十六烷基三甲基溴化铵）,SDS,法,（十二烷基磺酸钠，,Sodium,dodecyl,sulfate,简称,SDS,）,二、非染色体,DNA,的提取,质粒,DNA,的提取,碱裂解法,煮沸法,线粒体、叶绿体,DNA,的提取,差速离心结合,SDS,裂解法,CTAB,法,（植物,DNA,提取经典方法）,原理：,CTAB,（,hexadecyltrimethylammonium,bromide,，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并,与核酸形成复合物。,该复合物在高盐溶液中（,0.7mol/L,NaCl,）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（,0.3 mol/L,NaCl,）时从溶液中沉淀。,通过离心就可将,CTAB,与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将,CTAB,与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，,CTAB,能溶解于乙醇中。,CTAB,提取缓冲液的配方,组份,Tris-HCl,（,pH8.0,）,EDTA（pH8.0）,NaCl,CTAB,-,巯基乙醇,终浓度,100,mM,20,mM,1.4M,2%(W/V),0.1%,（,V/V,）,使用前加入,Tris-HCl,（,pH8.0,）,提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；,Tris,(,三羟甲基氨基甲烷,),EDTA,螯合,Mg,2+,或,Mn,2+,离子，抑制,DNase,活性；,NaCl,提供一个高盐环境，使,DNP,充分溶解，存在于液相中；,CTAB,溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；,-,巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除,CTAB,提取缓冲液的改进配方,组份,Tris-HCl,（,pH8.0,）,EDTA（pH8.0）,NaCl,CTAB,PVP40,-,巯基乙醇,终浓度,100,mM,20,mM,1.4M,3%(W/V),5%(W/V),2%,（,V/V,）,使用前加入,PVP,（,聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少,DNA,中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。,CTAB,法提取植物,DNA,的操作步骤,1,称取,2,5g,新鲜菠菜幼嫩组织或小麦黄花苗等植物材料，用自来水、蒸馏水先后冲洗叶面，用滤纸吸干水分备用。叶片称重后剪成,1cm,长，置研钵中，经液氮冷冻后研磨成粉末。待液氮蒸发完后，,加入,15mL,预热（,60,65,）的,CTAB,提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，置于,65,水浴保温,0.51h,，不时地轻轻摇动混匀。,CTAB,法提取植物,DNA,的操作步骤,加等体积的氯仿,/,异戊醇,(24,:,1),，盖上瓶塞，温和摇动，使成乳状液。,将锥形瓶中的液体倒入离心管中，在室温下,4 000r/min,离心,5min,，静置，离心管中出现,3,层，小心地吸取含有核酸的上层清液于量筒中，弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。,CTAB,法提取植物,DNA,的操作步骤,根据需要，上清液可用氯仿,/,异戊醇反复提取多次。,收集上层清液，并将其倒入离心管中。慢慢加入,1,2,倍体积预冷的,70%,乙醇。可看到纤维状的沉淀（主要为,DNA,）。离心，即得到,DNA,粗制品。,CTAB,法提取植物,DNA,的操作步骤,6,上述,DNA,粗制品含有一定量的,RNA,和其它杂质。若要制取较纯的,DNA,，可将粗制品溶于,TE,缓冲液中，加入,10mg/mL,的,RNase,溶液，使其终浓度达,50g/mL,，混合物于,37,水浴中保温,30min,除去,RNA,。,CTAB,法提取植物,DNA,的操作步骤,7 70,乙醇沉淀,DNA,。最后，将,DNA,溶于,250L,的,TE,缓冲液中。,CTAB,法流程图,植物材料,裂解液,上层溶液,液氮研磨,抽提,细胞裂解,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,DNA,溶液,为了保证植物,DNA,的完整性，在吸取样品、抽提过程中应注意什么？,（,1,）整个提取过程应在较低温度下进行（一般利用液氮或冰浴）；这样可防止和抑制内源,DNase,对,DNA,的降解；,（,2,）当,DNA,处于溶解状态时，要尽量减弱溶液的涡旋，动作要轻柔；在进行,DNA,溶液转移时用大口（或剪口）吸管，尽量减少对溶液中,DNA,的机械剪切破坏。,质粒,DNA,的提取 碱裂解法,质粒,DNA,的提取碱裂解法,染色体,DNA,比质粒,DNA,分子大得多，且染色体,DNA,为线状分子，而质粒,DNA,为共价闭合环状分子；,当用碱处理,DNA,溶液时，线状染色体,DNA,容易发生变性，共价闭环的质粒,DNA,在回到中性,pH,时即恢复其天然构象；,变性染色体,DNA,片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒,DNA,分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,原理：,在碱性条件下线状,DNA,发生变性，质粒,DNA,维持环状。,在高盐条件下作复性处理，变性的染色体,DNA,会形成沉淀，从而将质粒,DNA,与染色体,DNA,分开。,溶液,I,（,50mmol/L,葡萄糖，,10mmol/L EDTA,，,25mMTris-HCl pH8.0,）,作用：分散细胞,溶液,II,(,0.2mol/L,NaOH,1%SDS),(,SDS,十二烷基硫酸钠）,作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。,溶液,III,（,3mol/L KAc,PH4.6,）,作用：酸性下质粒,DNA,复性，变性蛋白、线性,DNA,沉淀。,提取大肠杆菌质粒,DNA,的步骤,1,取制备好的菌液,1.5ml,通过离心沉淀得到的菌体悬浮于,100ul,预冷的溶液,中，震荡使细胞分散。,2,在冰水浴中,5min,后，加入,200ul,溶液,，快速颠倒几次，使充分混匀。此时，混合液的PH,值在,12.6,，使细胞壁破裂，,DNA,变性。,3 DNA,的分离抽提。,将离心管置于冰水浴中,5min,后，加入,150mL,预冷的溶液,，颠倒离心管和震荡,10s,，使其混匀。,置于冰水浴中,5min,。此时的,PH,值在,7.0,使质粒,DNA,选择性复性，而染色体,DNA,随,SDS,和蛋白质一起沉淀下来。,4 4,，,12000rpm,离心,5min,，吸取上清液移到另一个离心管。,5,去蛋白质，加氯仿,/,异戊醇,6,重复,4,7,向上清液中加入,2,体积的无水乙醇，,-20,下放置,30min,，沉淀,DNA,。,8 4,，,12000rpm,离心,5min,，弃上清液,9,在超净工作台吹干,10,加入,50ulTE,，,-20,保存备用。,液氮罐 制冰机,高速冷冻离心机,思考题：,1,植物基因组,DNA,提取原理与基本步骤,2,大肠杆菌质粒,DNA,提取原理与基本步骤,