生物化学 第二章 蛋白质化学 下.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,四 超二级结构和结构域,超二级结构（,supersecondary,structure,）是指在多肽链中彼此邻近的二级结构在空间折叠时相互靠近，相互作用，形成了一个有规则的二级结构聚集体，称为超二级结构。,目前发现的超二级结构有,螺旋组合（,）、,折叠组合（,）和,螺旋,折叠组合（,），其中以,组合最为常见。这些超二级结构可以直接作为组成单位参与三级结构或结构域的构建，它是蛋白质构象中二级结构与三级结构之间的一个过渡层次，故称超二级结构。也称为基元,(motif),或基序或模体。,蛋白质的超二级结构是指由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则在空间上能够辨认的二级结构组合体，有三种基本组合形式,、,、,。,结构域（,Structural Domain,）是介于二级和三级结构之间的一种结构层次。是指蛋白质,亚基,结构中明显分开的紧密球状结构区域，是蛋白质三级结构内的独立折叠单元。结构域通常都是几个超二级结构单元的组合。,结构域与结构域之间常常有一段长短不等的肽链相连，形成所谓铰链区。不同蛋白质分子中结构域的数目不同，同一蛋白质分子中的几个结构域彼此相似或很不相同。常见结构域的氨基酸残基数在,100,400,个之间，最小的结构域只有,40,50,个氨基酸残基，大的结构域可超过,400,个氨基酸残基。,结构域一般都具有一定的功能。也叫模体（,motif,）或基序,-,螺旋,-,转角,HTH,模体结构示意图,螺旋,-,转角,-,螺旋模体由,2,个,螺旋和,1,个,转角组成。,HTH,模体是,DNA,结合蛋白三维结构中的一部分，每一,DNA,结合蛋白含一个,HTH,模体，位于分子表面。,DNA,结合蛋白常以二聚体形式存在，两个,HTG,模体相距,3.4nm,，与,DNA,的螺距相当，分别结合于,DNA,分子中相邻的两个深沟中。,HTH,模体约由,20,个氨基酸残基组成，第,1,个,螺旋含,7,个氨基酸残基，,转角含,4,个氨基酸残基，第,2,个,螺旋含,9,个氨基酸残基。第,2,个,螺旋是,DNA,识别部位，结合于,DNA,分子的深沟中。,螺旋,螺旋,转角,N,C,模体：在许多蛋白质的分,子中，常发现几个（多为,2,3,个）具有二级结构的,肽段相互靠近，形成具有,特定功能的空间构象；或,者仅是一个具有特定功能,的很短的肽段。,模体（,motif,）,五 球状蛋白的三级结构,由蛋白质二级结构、超二级结构或结构域相互连接组合形成的蛋白质构象结构称谓蛋白质三级结构。,具有三级结构的多肽链称谓亚基（,subunit,）。单个多肽链构成的蛋白，具有三级结构才能有活性。多条肽链形成蛋白，需要亚基进一步组合才能有活性。,亲水基团在外，疏水基团在内，形成疏水核心。,维持蛋白质三级结构的化学键为非共价键,氢键；盐碱（离子键）；疏水键；范德华力；配,位键；二硫键,六 蛋白质四级结构,由两条或以上的具有三级结构的多肽链以非共价键形式组合在一起，形成的结构称谓蛋白质四级结构。,1,2,2,1,N,C,N,C,血红蛋白的四级结构,成人血红蛋白由,2,条,链和,2,条,链组成,各亚基分别含一个血红素,.,第四节 蛋白质结构与功能关系,自然规律：结构决定功能，功能反应结构,一 蛋白质一级结构决定高级结构,二 结构与功能,一级结构,相似蛋白序列相似；,氨基酸变异造成功能丧失。,空间结构与功能,构象与功能,镰刀型贫血症：,表,中九种,动物之间胰岛素分子一级结构中存在的氨基酸残基组成,的差异不影响胰岛素的生物活性。临床上曾经应用猪和牛的胰岛素治,疗人的糖尿病，取得了显著的疗效。,胰岛素分子中氨基酸残基的差异部分,来 源,氨基酸残基的差异部分,A8 A9 A10 B30,人,Thr,Ser Ile,Thr,猪,The Ser Ile Ala,狗,Thr,Ser Ile Ala,兔,Thr,Ser Ile Ser,牛,Ala Ser Val Ala,羊,Ala,Gly,Val Ala,马,Thr,Gly,Ile Ala,抹香鲸,Thr,Ser Ile Ala,鲸,Ala Ser,Thr,Ala,丝氨酸蛋白酶,催化基团丝氨酸周围的固定氨基酸序列,丝氨酸蛋白酶是活性中心含有丝,(,或苏,),氨酸的蛋白水解酶家族。,从表中可见，其活性部位丝氨酸（,195,）附近的氨基酸残基序列相,似。表中蓝色标记的氨基酸为同源序列。丝氨酸蛋白酶具有相似的,一级结构和相似的三级结构。,动物体细胞色素,C,一级结构的进化树,图中的数字表示该类动物与其祖先相比细胞色素,C,一级结构氨基酸残基的差异数,0,1 0,12 11 0,11 10 1 0,10 9 3 2 0,11 10 6 5 3 0,10 9 5 4 2 3 0,9 8 6 5 4 5 2 0,10 11 7 8 6 7 6 6 0,13 12 11 10 9 10 9 8 12 0,13 12,12,11 10,10,9 8 10 2 0,11 10,10,9 8 8 7 6 10 3 3 0,14 15 22 21 20 21 19 18 21 19 20 17 0,15 14 11 10 9 9 8 9 11 8 8 7 22 0,18 17 14 13 11 12 11,11,13 11 12 11 24 10 0,21,21,19 18 17 18 17,17,18 17 18 17 26 18 15 0,27 26 22,22,22,21 22 21 24 23 24 22 29 24 22 24 0,31 30 29 28 27 25 27 26 28,28,27,27,31 28 29 32 14 0,人,猩猩,猕猴,马,驴,猪、牛、羊,狗,小灰鲸,兔,袋鼠,鸡、火鸡,企鹅,北京鸭,响尾蛇,啮龟,牛蛙,金枪鱼,螺旋蝇,蚕蛾,蚕蛾,螺旋蝇,金枪鱼,牛蛙,啮龟,响尾蛇,北京鸭,企鹅,鸡，火鸡,袋鼠,兔,小灰鲸,狗,猪牛羊,驴,马,猕猴,人，猩猩,人与,一些动物细胞色素,C,一级结构氨基酸差异的数量比较,磷酸丙糖异构酶和丙酮酸激酶结构域,1,空间构象的相似性,磷酸丙糖异构酶催化,3-,磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮的互变，丙,酮酸激酶催化磷酸烯醇式丙酮酸转移磷酸基生成,ATP,和烯醇式,丙酮酸，但其空间结构具有相似性，其空间结构的中心均是由,8,个,-,折叠组成的,-,折叠桶，每个,-,折叠又被螺旋所分隔,磷酸丙糖异构酶,丙酮酸激酶结构域,1,朊病毒与蛋白质构象病,朊病毒蛋白（,prion,protein,PrP,）,是正常存在于人体神经,原、神经胶质细胞等多种细胞的细胞膜上的糖蛋白。朊病毒,（,prion,PrP,sc,）,是正常朊病毒蛋白（,PrP,c,）,的空间构象由,螺,旋变成,折叠所致。,朊病毒本身不能自我复制，但可以攻击大脑的正常朊病,毒蛋白，使之构象改变并与其结合，形成朊病毒二聚体。此,二聚体现再攻击正常朊病毒蛋白，形成朊病毒四聚体。周而,复始，脑组织中朊病毒不断积蓄，造成脑组织发生退行性病,变。,正常朊病毒蛋白与朊病毒空间结构的差异,朊病毒（,PrP,sc,）,是蛋白质，不含核酸。它是正常朊病毒蛋白（,PrP,c,）,的空间,构象由,-,螺旋变成,-,片层结构所致。因此，这类疾病又称蛋白质构象病。朊病毒,本身不能复制，但它却可以攻击大脑的正常朊病毒蛋白，使其发生构象改变，,并与其结合，成为致病的朊病毒二聚体。此二聚体再攻击正常的朊病毒蛋白。这,样，脑组织中的朊病毒不断积蓄，造成脑组织发生退行性变。,正常朊病毒蛋白结构,（显示,-,螺旋,）,朊病毒结构,（显示,-,片层结构,）,具体几种蛋白的功能,胰岛素（,Insulin,）,血红蛋白（,Hemoglobin,）,免疫球蛋白（,Immunoglobulin,）,膜蛋白结构,前蛋白原的活化,人胰岛素的一级结构,胰岛素由,A,、,B,两条多肽链组成，,A,链含,21,个氨基酸残基，,B,链含,30,个氨基酸残基。,A,链内有一个链内二硫键，,A,与,B,之间有两个链间二硫键。由于两条链之间由共价键相连接，所以胰岛素没有四级结构。,Ser,Gly,Ile,Val,Glu,Gln,Cys,Cys,Thr,Ile,Cys,Ser,Leu,Tyr,Gln,Leu,Glu,Asn,Tyr,Cys,Asn,Phe,Val,Asn,Gln,His,Leu,Cys,Gly,Ser,His,Leu,Val,Glu,Ala,Leu,Tyr,Leu,Val,Cys,Gly,Gly,Glu,Arg,Phe,Phe,Tyr,Thr,Pro,Lys,Thr,NH,2,1,5,10,15,20,COOH,A,链,NH,2,1,5,10,15,20,25,30,HOOC,B,链,胞外区,跨膜区,胞内区,第五节 蛋白质性质,一 蛋白质胶体性质,亲水胶体,(1-100nm,的,),粒子，具有胶体溶液性质（真溶液）,丁达尔现象；布朗运动；不透过半透膜；稳定胶体溶液（真溶液）。,透析,(dialysis):,磁力搅拌器,透析前,透析后,透析袋,通过透析，小分子通透透析袋，散布于透析液中，大分子量的蛋白质不能通透透析袋，留在透析袋内。从而，蛋白质溶液中的小分子物质通过透析被分离除去。,形成稳定胶体溶液的因素：,水化膜和同性电荷,蛋白质所带电荷和其周围包绕的水化膜是维持蛋白质在水溶液中稳,定的两大因素。脱水和中和电荷可以导致蛋白质的沉淀。,水化膜,正电荷,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,H,+,OH,-,OH,-,OH,-,H,+,H,+,脱水,脱水,脱水,蛋白质,在等电点时的亲水,胶体,带,负电荷的亲水胶体,蛋白质,蛋白质,蛋白质,蛋白质,蛋白质,带,正电荷的亲水胶体,带,正电荷的疏水胶体,不,带电的疏水胶体,（极易沉淀）,带,负电的疏水胶体,负电荷,二 两性解离和等电点,pI,pH,pH,三 蛋白质变性作用和复性,牛胰核糖核酸酶分子的变性与复性,变性是指蛋白质在一些理化因素的作用下，其正常的空间构象遭到破坏，主要是次级键或二硫键发生破坏，导致蛋白质的理化性质的改变（如溶解度下降、粘度增加）和生物学活性的丧失。蛋白质的变性不影响其一级结构,。,三 蛋白质变性作用和复性,变性,物理因素：加热、紫外线照射、超声、剧烈震荡等,化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等,沉淀,改变,pH,至,pI,破坏水溶液中蛋白质,的水化膜和中和电荷,（变性蛋白质）,（蛋白质未变性）,凝固,加热,（变性，不再溶解）,变性不一定沉淀,沉淀不一定变性,凝固均变性并不溶解,加热,蛋白质变性（,Denaturation,）,蛋白质复性（,Renaturation,)四 蛋白质沉淀（,sedimentation,）作用,precipitation,（沉淀）；,Aggregation,（凝集）,1,中性盐法,盐析（,salting-out,）；分段盐析（,grading salting-out,）,重金属盐,2,有机溶剂 乙醇；丙酮,3,生物碱 单宁酸；苦味酸,4,有机酸 三氯乙酸,第六节 蛋白质分离纯化与测定,一 一般原则步骤,材料获得与破碎（机械、渗透、冻融、超声和酶解等）,蛋白抽提,蛋白粗体（沉淀）,蛋白质分离（精纯化）,测定：浓度；纯度；分子量；性质功能鉴定等,蛋白质的理化性质与常用的纯化方法,二 蛋白质的提取与纯化原理,（一）改变蛋白质的溶解度,盐析：,高浓度中性盐使蛋白质从溶液中析出,有机溶剂沉淀：,降低溶液的介电常数，使蛋白质分子间,相互吸引而沉淀,（二）根据蛋白质分子大小不同的分离方法,离心,(centrifugation),：,利用机械的快速旋转所产生的离心力，将不同密,度的物质进行分离,根据转速分类：,常用离心机,50 000 rpm,相对离心力（,g,）,=1.119,10,5,（,rpm,）,2,r,根据应用分类：,分析型离心机,制备型离心机,g:gravity,rpm:revolution per,minut,r:,离心半径,匀浆,沉淀,上清,1 000g,5min,上清,上清,上清,上清,沉淀,沉淀,沉淀,沉淀,沉淀4 000g,10min,15 000g,20min,30 000g,30min,100 000g,90min,100 000g,180min,（未破坏的,真核细胞）,（细胞膜碎,片，细胞核）,（线粒体，,细菌）,（溶酶体，,菌体碎片）,（微粒体）,（核糖核蛋白体）,胞液,亚细胞成分的差速离心分离,差速,离心法是沉降速度离心的一种，采用离心力由小到大的分阶段离心的办法，将密度不同的物质分步骤地逐一分离开来。亚细胞结构的分离就是其中最好的例子。,差速,离心法,几种蛋白质的分子量与沉降系数的关系,在,单位力场下，溶质分子的沉降速度与离心角速度、离心半径呈正比，其比例常数为沉降系数，用,S,表示，单位为秒。,=s,2,一般蛋白质的沉降系数为,10,13,10,12,秒，故人们以,Svedberg(S,),单位来表示沉降,系数，即,1S=10,13,秒。沉降系数的大小与蛋白质的密度和形状相关。,透析,(dialysis):,磁力搅拌器,透析前,透析后,透析袋,通过透析，小分子通透透析袋，散布于透析液中，大分子量的蛋白质不能通透透析袋，留在透析袋内。从而，蛋白质溶液中的小分子物质通过透析被分离除去。,超,滤（,ultrafiltration,）,:,在一定的压力下，使蛋白质溶液在通过一定孔径的,超滤膜时，小分子量物质滤过，而大分子量的蛋白质被,截留，从而达到分离纯化的目的。这种方法既可以纯化,蛋白质，又可达到浓缩蛋白质溶液的目的。,磁力搅拌器,待超滤的,蛋白质溶液,加压的氮气,超滤膜,凝胶,过滤（,gel filtration,）：,凝胶过滤,又称分子筛层析，在层析柱内填充惰性的,微孔胶粒（如交联葡聚糖），将蛋白质溶液加入柱上部,后，小分子物质通过胶粒的微孔进入胶粒，向下流动的,路径加长，移动缓慢；大分子物质不能或很难进入胶粒,内部，通过胶粒间的空隙向下流动，其流动的路径短，,移动速度较快，从而达到按不同分子量将溶液中各组分,分开的目的,洗脱液,胶粒,样品,小,分子,大分子,蛋白浓度,洗脱,体积,各,试管进行连续收集,试管走行方向,凝胶过滤分离蛋白质示意图,凝胶,过滤,凝胶过滤分离蛋白质示意图,根据各种蛋白质在一定的,pH,环境下所带电荷种类,与数量不同的特点，将不同蛋白质予以分离。,常用的方法有：,离子交换层析,电泳,等电聚焦。,（三）根据蛋白质电荷性质的分离方法,低盐,浓度,洗脱液,高盐,浓度,洗脱液,各,试管进行连续收集,混合蛋白质,离子交换层析柱,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,离子交换层析分离蛋白质示意图,试管走行方向,离子交换层析,(ion exchange chromatography),：,离子交换层析分离蛋白质示意图,原点,带,负电荷蛋白质的泳动方向,滤纸、醋酸纤维素,薄膜或其他支持物,阳极,阴极,电极缓冲液,电极缓冲液,电泳示意图,电泳（,electrophoresis,）：,聚丙烯酰胺凝胶电泳,上,电极缓冲液,下,电极缓冲液,样品槽,上样器,阴极,阳极,电泳方向,聚丙烯酰胺凝胶板,等电,聚焦（,isoelectric,focusing,IEF,）,:,在具有,pH,梯度的电场中进行的电泳。每种蛋白质均有其特定的等电点，在,pH,呈梯度的电场中，按其等电点不同，带有不同的电荷，于是向与其带电相反的电极方向泳动。这样，在电泳时某一蛋白质迁移到电场中某一处的,pH,等于其等电点时，该蛋白质便因不带电荷而停止泳动。这样，各种蛋白质按其等电点不同得以分离。,+,(H,2,SO,4,),(,NaOH,),pH3,pH10,+,(H,2,SO,4,),(,NaOH,),pI,4.5 5.1 6.0 7.9 8.1,pH3,pH10,将,第一相胶条,加到第二相电,泳中，走向与,第一相垂直,等电聚焦,(IEF),pH3.0,pH10.0,第一相,IEF,按,pI,进行分离,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳,（,SDS-PAGE,）,电泳走向,第二相,SDS-PAGE,按分子大小分离,pH3.0,pH10.0,+,+,双向电泳（,two dimensional electrophoresis,）：,分离纯化方法,凝胶过滤法,离子交换法,亲和层析法,高压液相色谱（,HPLC,）,凝胶电泳（,PAGE,）,离心法,三 分子量测定,凝胶过滤,SDS-PAGE,超速离心,最低分子量法,四 蛋白质纯度鉴定：电泳纯,五 蛋白质含量测定,