蛋白质药物的PEG化学修饰.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,蛋白质药物的,PEG,化学修饰,胡 涛,中国科学院过程工程研究所,生化工程国家重点实验室,1.,迅速被体内酶降解,2.,肾小球过滤清除,3.,抗原抗体反应,4.,溶解度差导致沉淀,蛋白质药物在使用中出现的问题,T,C,实际浓度,理想浓度,体外聚乙二醇修饰（,PEG,化）,(1),增大药物分子量，避免被肾小球过滤,(2),阻碍蛋白酶的降解作用,(3),屏蔽药物的免疫位点,(4),增加药物在体液中的溶解度,(5),与药物间的化学键在体内随时间水解，缓慢释放药物,+,蛋白或多肽,偶联物,聚乙二醇,CH,3,(-O-CH-CH),n,-OH,分离工程,反应工程,剂,型工程,生物医药,生物能源,生物材料,生物化学品,其它产品,生化工程,（生物化学工程，,Biochemical Engineering,）,目 录,PEG,修饰的国内外研究进展,PEG,修饰剂的研发,PEG,修饰方法,PEG,修饰工艺的优化,PEG,修饰产物的质量控制,一、,PEG,修饰的国内外研究进展,国际上,PEG,修饰技术的研究进展,美国,Rutgers,大学,Davis,教授,70,年代的工作,甲氧基,PEG,的应用,美国,Enzon,公司,美国最早从事,PEG,修饰蛋白质药物的公司,美国,Shearwaters,公司,各种,PEG修饰剂的生产商,美国罗氏、先灵宝雅、安进,PEG,药物：,PEG-INF,，,PEG-G-CSF,其它：辉瑞、默克、葛兰素史克、施贵宝。,国内,PEG,修饰技术的研究进展,国家,863,重大机密项目：人工血液代用品的研制，,1997-2000,中国科学院重点项目：血液代用品和血液净化，,2001-2005,国家重大科技专项课题,创新药物和中药现代化,：长效基因工程蛋白质和多肽制剂关键技术，,2002-2005,国家,863,重点项目课题：核酸和多肽的修饰和剂型化技术，,2007-2010,PEG,修饰血红蛋白：,I,期临床,（中科院过程所、凯正公司）,PEG,修饰,G-CSF,：,III,期临床,（格兰百克）,修饰粒细胞集落刺激因子（,rhG,-CSF,）延长半衰期,修饰人肿瘤坏死因子消除副作用,修饰白介素,I,受体拮抗剂（,rhIL-1Ra,）延长半衰期,修饰牛胰核糖核酸酶（,RNase,）提高抗肿瘤活性,修饰超氧化物歧化酶（,SOD,）提高半衰期,修饰天冬酰氨酶（,Aspartase,）克服免疫原性,提高半衰期,修饰人干扰素（,IFN,）提高半衰期,修饰血红蛋白（,Hb,）血液代用品,修饰胰岛素提高半衰期,我国在,PEG,修饰蛋白质方面的一些工作,二、,PEG,修饰剂的研发,Sc-PEG,专利分析,以,PEG-OH,为原料的必然途径,CH,3,OCH,2,CH,2,(OCH,2,CH,2,),n,OH +,光气,+,NHS,CH,3,OCH,2,CH,2,(OCH,2,CH,2,),n,O-C-O-N,+,NH,2,G-CSF,O,O,O,CH,3,OCH,2,CH,2,(OCH,2,CH,2,),n,O-C-NH,G-CSF,O,单链修饰：,(,SC-PEG),Roche,公司的长效干扰素产品专利分析,同样是以,PEG-OH,为原料的必然途径,双链修饰：,新的修饰策略,采用新方法制备新的修饰剂,以,PEG-COOH,（,CM-PEG),为原料的必然途径，已获专利,CH,3,(OCH,2,CH,2,),n,OCH,2,CH,2,OH,CH,3,(OCH,2,CH,2,),n,O-CH,2,C-O-N +NH,2,G-CSF,O,O,O,单链修饰：,CH,3,(OCH,2,CH,2,),n,OCH,2,COOH,CH,3,(OCH,2,CH,2,),n,O-CH,2,C-NH,G-CSF,O,(,CM-PEG),我们的策略,以,PEG-COOH,为原料的必然途径,CH,3,(OCH,2,CH,2,),n,O-CH,2,C-NH,O,O,O,双链修饰：,CH,3,(OCH,2,CH,2,),n,OCH,2,COOH +Lysine,O,CH,3,(OCH,2,CH,2,),n,O-CH,2,C-NH-,O,(,CH,2,),3,CH,2,CH-C-O-N,NH,2,IFN,CH,3,(OCH,2,CH,2,),n,O-CH,2,C-NH,O,O,CH,3,(OCH,2,CH,2,),n,O-CH,2,C-NH,-,O,(,CH,2,),3,CH,2,CH-,C-NH,IFN,1,、,PEG,修饰剂的批量制备取得了成功,取 得 的 主 要 进 展,分枝型,ZL 01141745.5,分叉,(,长尾,),型,ZL 03100736.8,可逆型,ZL03105003.4,不可逆型,200410029577.1,ZL02120740.2,异端基双官能团,200410029577.1,聚乙二醇修饰剂产品,产品号,末端基团,分子量,包装（,g,）,价格mPEG-OH5,-OH,5K,100,10,3500,700,mPEG-OH10,-OH,10K,100,10,7000,1400,mPEG-OH20,-OH,20K,100,10,7000,1400,mPEG-COOH5,-COOH,5K,100,10,10000,2000,mPEG-COOH10,-COOH,10K,100,10,15000,3000,mPEG-COOH20,-COOH,20K,100,10,20000,4000,MPEG-NHS5,-N-,羟基琥珀酰亚胺,5K,100,10,5,20000,4000,2000,MPEG-NHS10,-N-,羟基琥珀酰亚胺,10K,100,10,5,30000,6000,3000,MPEG-NHS20,-N-,羟基琥珀酰亚胺,20K,100,10,5,35000,7000,3500,三、药用蛋白的,PEG,修饰方法,创新技术（反应器技术和产物移走技术）,振荡反应器,流加反应器,缓释反应器,固相反应方式,膜耦合反应方式,双水相反应方式,Q.,Yun,R.Yang,T.Chen,J.Bi,G.Ma,Z Su.J.Biotechnology,2005,118:67-74,中国发明专利，申请号,200510114930.0,中国发明专利，申请号,0410029577,1.,修饰反应器设计,PEG-pellet,反应器,吸附蛋白,加入,PEG,PEG,修饰,洗脱,2.,固相吸附法制备,PEG,修饰蛋白,固相吸附法与液相吸附法的比较,1,峰：原蛋白；,2,峰：单修饰蛋白；,3,峰：多修饰蛋白,PEG-INF,的制备过程,G-CSF,PEG-G-CSF,CH,3,(-O-CH-CH),n,-OH,甲氧基,PEG,（,mPEG,-OH,）,活化的,mPEG,-O-,醛,3.PEG,醛制备单修饰的药用蛋白,粒细胞集落刺激因子,(,G-CSF),MW:18.8kd(174 amino acids),pI,:6.1,1,thiol,1 N-terminal,4,lysines,Half life:5,h,Weekly,injection:7 times,三批,PEG30-rhG-CSF,产品的制备,取 得 的 主 要 进 展,序号,产品批号,试制日期,试制量,1,200708001,2007-8-5,2007-8-15,共,3750 mg,：,6 mg/,支，,302,支；,3 mg/,支，,210,支；,1.5 mg/,支，,520,支；,6.6 mg/ml,，,80 ml,2,200709001,2007-9-8,2007-9-18,共,1263 mg,：,3 mg/,支，,400,支；,3.15 mg/ml,，,20 ml,3,200710001,2007-10-9,2007-10-21,共,1422 mg,3 mg/,支，,400,支；,3.4 mg/ml,，,65 ml,。,PEG,化重组人生长激素,，批产量,1-10g,；,PEG,化降纤酶,，批产量,6000,支,；,环孢素,A,眼用微乳制剂,，批产量,5000,支,PEG,化,G-CSF,2L,修饰反应器,计算机程序控制,批产量,3g,生产周期,10,天,修饰和剂型化产品质量达到国际先进水平,生产规模,产品质量,批次稳定性,1 2 3,1,2,3,1,2,3,(A),(B),(C),以分子量为,30kDa,的,PEG,修饰,rhG,-CSF,为例,：,(A),三批产品的,SDS-PAGE,检测图谱,(B),三批产品的高效凝胶过滤检测图谱,(C),三批产品的园二色检测图谱,4.,引入巯基的方法制备,PEG,修饰蛋白,(2),PEGylation,S,NH,+,(1),Thiolation,HS-(CH,2,),3,-C-NH-Hb,NH,+,N,O,O,PEG,-S-(CH,2,),3,-C-NH-Hb,NH,+,O,PEG,N,O,2-iminothiolane,NH,2,-Hb,Sangart,公司是一家私营的生物制药公司，主要从事氧载体的研发和产业化,Hemospan,-,MP4,Phase I Sweden,Status:Complete,Phase,Ib,/II Sweden,Status:Complete,Phase II Sweden,Status:Complete,Phase II USA,Status:Enrollment,Complete,Phase III Europe,Status:Enrollment,Complete,该,PEG,修饰产物的凝胶过滤分析,四、,PEG,修饰工艺的优化,PEG,修饰反应参数的优化,建立反应动力学，包括位点反应动力学和蛋白分,子反应动力学，优化反应时间,优化反应的,pH,值,优化,PEG,与蛋白的摩尔比,优化反应体系,p,Time,p,p,p,p,p,蛋白分子的修饰反应动力学,Weijun,Li,Zhiguo,Su.Quantitatively investigating,monomethoxypolyethylene,glycol modification of protein by capillary electrophoresis,J.,Biochem,.,Biophys,.Methods.2004,，,59:65-74,PEG,修饰的位点反应动力学,PEG,醛修饰药用蛋白的优化反应,单修饰产物的分离纯化,P1 P2,分离产物分析,6.5,14.3,29.0,66.4,20.1,116,200,KDa,44.3,P1 P2,P1,凝胶过滤分析,膜耦合修饰工艺制备,PEG,化药用蛋白,五、,PEG,修饰产物的质量控制,IEF,和,SDS-PAGE,鉴定,PEG,修饰蛋白,1,2,3,4,+,-,Iodine stain,Comassie,blue stain,SDS-PAGE,IEF,1:Marker,2:,HbA,3:,-,Hb,4:(Propyl-PEG5K),6,-Hb,5:(Propyl-PEG5K),6,-,-Hb,1:,HbA,2:,-,Hb,3:(Propyl-PEG5K),6,-Hb,4:(Propyl-PEG5K),6,-,-Hb,1,2,3,4,4,5,5,94.0,66.2,43.0,31.0,20.1,14.4,RP-HPLC,分析胰蛋白酶切片段,质谱,分析胰蛋白酶切片段,MALDI-TOF/TOF,分析,PEG,修饰位点在,Val-1(,),PEG,修饰蛋白的结构鉴定,圆二色光谱鉴定,荧光光谱鉴定,RP-HPLC,分析,PEG,修饰蛋白,蛋白质修饰剂及其制备方法和用途,中国发明专利，,ZL01141745.5,制备分枝型聚乙二醇的新方法,中国发明专利，,ZL02120740.2,带,PEG,长尾的蛋白质修饰剂的制法和用途,中国发明专利，,ZL031100736.8,聚乙二醇羧酸的制备方法和其用途,中国发明专利，,ZL,200310113367.6,重组人复合干扰素-聚乙二醇偶联物的制备及其偶联产物,中国发明专利，,ZL 2,00410029577.1,一种蛋白质交联剂及其交联方法,中国发明专利ZL 03105003.4,一种分级分离制备血红蛋白偶联物的方法,中国发明专利，,ZL 99106228.0,一种二醇聚合物,动物血红蛋白偶联物的制备方法,中国发明专利，,ZL 99106229.9,一种二醇聚合物,动物血清白蛋白偶联物的制备方法,中国发明专利,ZL 00123696.2,分子量均一的聚合物血红蛋白的制备方法,中国发明专利,ZL 01136190.5.,血红蛋白,-,人血清白蛋白偶联物制备血液代用品及其制备方法,中国发明专利，,Z,L 03109622.0,蛋白质修饰国家发明专利,11,项（已授权）,PEG,修饰的,SCI,论文,Q,Yun,T Chen,G Zhang,J Bi,G Ma,Z Su.A novel polyethylene glycol derivative suitable for the preparation of mono-,PEGylated,protein.,Biotech,Lett,27,213-217,2005,Q,Yun,R Yang,T Chen,J Bi,G Ma,Z Su.Reproducible preparation and effective separation of,PEGylated,recombinant human granulocyte colony-stimulating factor with novel“PEG-pellet”,PEGylation,mode and ion-exchange chromatography.J Biotech.,2005,118:67-74,Q,Yun,M He,W Xing,J Bi,G Ma,Z Su,A novel,tetrafunctional,reagent for simultaneous,intramolecular,and intermolecular cross-linking of bovine hemoglobin,Biotech,Lett,26:1359-1363,2004.,X Li,F,Meng,G Ma,Z Su,A simple and efficient method for synthesis of,carboxymethylated,polyethyleneglycol,.J,Chem,Res,In press.,J Zhang,Y Zhao,Z Su,G Ma,Synthesis of,Monomethoxy,Poly(ethylene glycol)without,Diol,Poly(ethylene glycol),J,Appl,Polym,Sci,105,37803786(2007).,J Zhang,Z Su,G Ma,Synthesis and Characterization of,Hetetotelechelic,poly(ethylene glycol)s with amino acid at one end and hydroxyl group at another end,J,Appl,Polym,Sci,in press.,C,Zheng,J Bi,G Ma,Z Su,Polyethylene Glycol Improves Conjugation of Bovine Hemoglobin and Human Serum Albumin in a Controlled Ratio,Artificial Cells,Blood Substitutes,and Biotechnology,35:568584,2007.,C,Zheng,G Ma,Zhiguo,Su,Native PAGE eliminates the problem of PEG-SDS interaction in SDS-PAGE and provides an alternative to HPLC in characterization of protein,PEGylation,Electrophoresis,2007,28:2801-2807,谢谢大家！,