琼脂糖凝胶电泳.ppt

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,DNA/RNA,的琼脂糖凝胶检测,一、实验原理,电,泳是现在用于分离和纯化,DNA/RNA,片段的最常用技术。当制备好的一块“胶”即一块包含电解质的多孔支持介质并把它置于静电场中，,DNA/RNA,分子将向阳极移动，这是因为,DNA/RNA,分子沿其双螺旋骨架两侧带有富含负电荷的磷酸根残基。,当,DNA/RNA,长度增加时，来自凝胶的阻力就会增加，不同长度的,DNA/RNA,片段就会出现不同的迁移率。因而就可依据,DNA/RNA,分子的大小使其分离,。,分离长度,凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳,200bp,近,50kb,聚丙烯酰胺凝胶电泳,5500bp,分辨率高,采用不同浓度的凝胶可以分辨范围广泛的,DNA,分子,。,含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围,凝胶中的琼脂糖含量,%,（,W/V,）,DNA/RNA,分子的分离范围（,kb,）,0.3,560,0.6,120,0.7,0.810,0.9,0.57,1.2,0.46,1.5,0.23,2,0.12,EB,染料,溴化乙锭（,EB,）是一种吖啶类染料，它在紫外灯照射下能发射荧光，当,DNA,样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的,EB,就插入,DNA,分子中形成荧光络合物，使,DNA,发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的,DNA,。,电泳缓冲液的组成,Tris,乙酸（,TAE,）,Tris,硼酸（,TBE,）,Tris,磷酸（,TPE,）,其浓度约为,50mmoL/L,，,PH,为,7.57.8,这些缓冲液均含有,EDTA,。这些缓冲液通常配制成浓缩液，贮存于室温,。,常用的电泳缓冲液的配制,缓冲液,使用液,浓贮存液（每升）,Tris,乙酸（,TAE,）,1,：,0.04moL/L,Tris,乙酸,0.001moL/L EDTA,50,：,242g,Tris,碱,57.7mL,冰乙酸,100mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0),Tris,磷酸（,TPE,）,1,：,0.09moL/L,Tris,磷酸,0.002moL/L EDTA,10,：,108g,Tris,碱,15.5mL 85%,磷酸,40mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0),Tris,硼酸（,TBE,）,0.50.045moL/L,Tris,硼酸,0.001moL/L EDTA,5,：,54g,Tris,碱,27.5g,硼酸,20mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0),加样缓冲液,缓冲液类型,6,缓冲液,贮存温度,I,0.25%,溴酚蓝,0.25%,二甲苯青,FF,40%,（,W/V,）蔗糖水溶液,4,II,0.25%,溴酚蓝,0.25%,二甲苯青,FF,15%,聚蔗糖水溶液,室温,III,0.25%,溴酚蓝,0.25%,二甲苯青,FF,30%,甘油水溶液,4,IV,0.25%,溴酚蓝,40%,（,W/V,蔗糖水溶液）,4,V,（碱性加样缓冲液）,300m,moL,/L,NaoH,6,mmoL,/L EDTA,18%,聚蔗糖水溶液,0,15%,溴甲酚绿,0,25%,二甲苯青,FF,4,加样缓冲液可以增大样品密度，以确保,DNA,均匀进入样品孔内，还可以使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利。,溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为二甲苯青,FF,的,2.2,倍,溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约与长,300bp,的双链线性,DNA,相同,而二甲苯青,FF,在琼脂糖凝胶中移动的速率则与,4kb,双链线性,DNA,相同。,DNA,片段长度标记,DNA,片段长度标记通常叫作,DNA Marker,本实验使用,Gene,RulerTM,DNA Ladder Mix,为,DNA,片段长度标记，分别由,100bp,、,200,bp,、,300,bp,、,400,bp,、,500,bp,、,600,bp,、,700,bp,、,800,bp,、,900,bp,、,1031,bp,、,1200,bp,、,1500,bp,、,2000,bp,、,2500,bp,、,3000,bp,、,3500,bp,、,4000,bp,、,5000,bp,、,6000,bp,、,8000,bp,、,10000,bp,组成，,DNA Marker,不仅可以作为凝胶中,DNA,片段长度的一个标记，还可以作为电泳的对照。,二、实验方法,1,50TAE,的稀释：如制备,50mL 1TAE,，取,1mL 50TAE,加入,49mL,水定容至,50mL,。,2,制备,1%,的琼脂糖胶液：取,0.2g,琼脂糖溶于,20mL TAE,中，在短时间里加热琼脂糖全部熔化，使溶液冷却至,60.(,加入浓度为,10mg/mL,的,EB 2L,，使,EB,的终浓度为,1g/mL),。,3,用于,RNA,电泳的电泳槽用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥后灌满,3%,的,H2O2,溶液，于室温放置,10,分钟，然后用,DEPCSDW,冲洗电泳槽，梳子同样处理。,4,用胶带封住胶床，放好梳子。,5,将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在,35mm,之间，凝固,2060min,。,6,在凝胶完全凝固之后，小心移去梳子，将胶床放在电泳槽内，加样孔一侧靠近阴极（黑极）。,7,向电泳槽中注入适量的,TAE,缓冲液，通常缓冲液高于胶面,1cm,。,8,分别将,DNA/RNA,样品与加样缓冲液混合,用移液枪将样品加入加样孔。,9,正确连接电泳槽和电源，设定稳压为,75V,，电流一般为,50mA,。,10,电泳结束后，在紫外观测仪上进行观察。,三、注意事项,与实验技巧,制胶和加样过程中要防治气泡的产生。,紫外光对人眼有害，观察时加盖玻璃罩，观察时间不宜太长EB,具有强诱变性，可致癌。必须戴手套操作，严格注意防护。,加样时，,Tip,头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁，否则样品渗漏或,DNA,带型不整齐。,配胶和灌电泳槽需使用同一批缓冲液。因为,pH,或离子强度很小的差别也会在凝胶前部造成紊乱，影响,DNA,片段的泳动。,梳板的选用 一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板，梳齿宽厚，形成的点样容积较大，用于,DNA,片段回收实验等；相反，梳齿窄而薄，形成的点样容积就较小，用于,PCR,产物、酶切产物鉴定等。一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。,四、跑出好看的电泳图,凝胶一定要加热熔解完全，均匀，可以对着光亮的地方看看清澈不清澈,；,一般情况下，梳子越薄而长，条带越好看,；,上样量不宜过多，会造成条带的相互挤压；,如果点样孔多余，将样点到中间，尽量避免边缘效应,，,中间电场比较均匀,；,做胶的缓冲液和跑胶的缓冲液浓度应该一致；,加样时不要太快，让其自然沉底，均匀分布在电泳孔内,；,电泳开始时可以采用低电压使其跑出孔后，再调高电压。,Thanks,农药学,