第四章 核酸电泳.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,核酸物质提取与电泳,天然,DNA,的制备,一般地说。总,DNA,主要是指基因组,DNA(genomic,DNA),，,即细胞核内的染色体,DNA,分子。核,DNA,分子呈极不对称的线状结构一条染色体为一个,DNA,分子。高等植物核,DNA,大约含有,10,6,bp,其长度与直径的比例极不对称使其对机械力十分敏感。虽然目前可以成功地测定出它的一级结构。但仍难以分离出它的完整分子。,1.,天然,DNA,的来源,(1),染色体,DNA,(2),病毒与噬菌体,(3),质粒,DNA,(4),线粒体与叶绿体,2.DNA的提取,细胞的破碎,破碎的手段：,物理方式：超声波法、匀浆法、液氮破碎法,:,容易导致,DNA,链的断裂,.,对于细胞破碎较困难的植物材料，可以辅加蛋白酶,K,，,在酶的存在下共同破碎细胞。,超生波,液氮,总,DNA,的提取方法：,去除,多糖,、,脂类,、,蛋白,等，得到的就是,核酸,去除多糖：,CTAB,、,PVP,、高盐溶液等,去除脂类：,SDS,、,CTAB,等,去除蛋白：,SDS,、蛋白酶、酚氯仿等,DNA,RNA,质粒,DNA,的提取,破坏细胞壁,溶菌酶、强碱和十二烷基磺酸钠,(SDS),裂解细胞膜,十二烷基磺酸钠,(SDS),、,Triton X-100,蛋白质及其它杂质的去除,SDS,使蛋白形成不溶物，沉淀出来,高浓度盐离子,(,KCl,),使变性蛋白、多糖、细胞碎屑等沉淀出来,细菌线形染色体,DNA,的去除,强热、碱,处理时，细菌线性染色体,DNA,变性，当快速降温、加入酸中和时，已变性的细菌线性染色体,DNA,变性不能快速复性，与其它杂质缠绕而沉淀出来,质粒,DNA,双链可快速恢复原状,重新形成超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。,3.DNA,的浓缩,(1),乙醇,(2),异丙醇,(3),聚乙二醇,(PEG600),工作区域应与进行普通微生物实验的区域分离好,RNA,的提取分离,RNA,提取的通用方法,异硫氰酸胍,/,苯酚法,原理：,细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；,释放出来的,DNA,和,RNA,由于在特定,pH,下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离,；,有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净,RNA,。,异硫氰酸胍,/,苯酚法,步骤,:,材料准备：,尽量新鲜。,裂解变性,：,异硫氰酸胍,（,亚硫氢胍，巯基乙醇，,N-,月桂肌氨酸等）。,使细胞及核蛋白复合物变性，释放,RNA,，,有效抑制核酸酶。,纯化分离：,苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚,/,氯仿可抽提去除杂物。,洗涤：,70,乙醇。,沉淀：,异丙醇、无水乙醇。,乙酸钠（,pH4.0,）：,维持变性的细胞裂解液的,pH,值，沉淀,RNA,。,此外还常用氯化锂选择沉淀,RNA,。,RNA,提取的通用方法,影响,RNA,提取的因素,材料,：,新鲜，切忌使用反复冻融的材料,如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在,TRIzol,或,样品贮存液中，于,70,或,20,保存,如要多次提取，请分成多份保存,液氮长期保存，,70,短期保存,影响,RNA,提取的因素,样品破碎及裂解,：,根据不同材料选择不同的处理方法：,培养细胞：,通常可直接加裂解液裂解,酵母和细菌：,一般,TRIzol,可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁,动植物组织：,先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻,样品量适当，保证充分裂解,为减少,DNA,污染，可适当加大裂解液的用量,纯化：,在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；,经典的纯化方法，如,LiCl,沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成,RNA,降解；,柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响,RNA,后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。,影响,RNA,提取的因素,RNA,提取常见问题,RNA,的降解,OD,260,/OD,280,比值偏低,电泳带型异常,下游实验效果不佳,RNA,降解,新鲜细胞或组织,：,裂解液的质量,外源,RNase,的污染,裂解液的用量不足,组织裂解不充分,另外某些富含内源酶的样品,(,如脾脏，胸腺等,)很难避免,RNA,的降解。,建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液,。,RNA,降解,冷冻样品：,样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至,-70,冰箱保存。样品要相对小一点；,先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；,样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。,OD,260,/OD,280,比值偏低,蛋白质污染：,不要吸入中间层及有机相,，,加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。,减少起始样品量，确保裂解完全、彻底,解决办法,:,重新抽提一次，再沉淀，溶解。,苯酚残留：,不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。,解决办法,:,重新抽提一次，再沉淀，溶解。,OD,260,/OD,280,比值偏低,抽提试剂残留：,确保洗涤时要彻底悬浮,RNA,，,并且彻底去掉,75%,乙醇。,解决办法,:,再沉淀一次后，溶解。,设备限制：,测定,OD260,及,OD280,数值时，要使,OD260,读数在,0.10-0.50,之间。此范围线性最好。,用水稀释样品：,测,OD,时，对照及样品稀释液请使用,10,mM,Tris,，,pH 7.5,。,用水作为稀释液将导致比值的降低。,电泳带型异常,非变性电泳：,上样量超过,3ug,，,电压超过,6V/cm,，,电泳缓冲液陈旧，均可能导致,28S,和,18S,条带分不开。,变性电泳条带变淡：,EB,与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；,甲醛的质量不高,。,下游实验效果不佳,RNA,降解,抽提试剂的残留,75%,乙醇洗涤,样品中杂质的残留,多糖等杂质，再次沉淀,DNA,污染,使用,RNase,-Free,的,DNase,I,消化抽提,RNA,RT,常见问题分析和解决方案,问题一：,少量或没有,RT-PCR,产物,RNA,降解,分离无污染，高质量的,RNA,；,防止,RNA,降解,RNA,中含逆转录酶抑制剂,70,（,v/v,）,乙醇清洗,RNA,沉淀，除去抑制剂,起始,RNA,量太低,增加,RNA,的量,多糖同,RNA,共沉淀,用氯化锂沉淀,RNA,以除去多糖,合成,cDNA,第一链合成的引物退火失败,确定退火温度适合所用的引物,RNA,模板存在较多二级结构,将,RNA,和引物在不含盐及缓冲液条件下变性,/,退火，提高逆转录反应温度,反转录成功，,PCR,失败,PCR,步骤中使用超过,1/5,的逆转录反应产物,可能原因,解决方案,问题二：,有非特异性带,引物和模板的非特异性退火,基因特异性引物设计较差,RNA,中有基因组,DNA,的污染,形成引物二聚体,镁离子浓度太高,提高反应的温度和特异性,提高引物的特异性,使用扩增级,DNase,处理,RNA,设计在,3,端没有互补序列的引物,优化镁离子浓度,可能原因,解决方案,RT,常见问题分析和解决方案,问题三：,产生弥散（,smear,）,条带,第一链产物的含量过高,PCR,反应中引物过多,循环数过多,退火温度过低,寡核苷酸片段产生的非特异性扩增,常规,PCR,步骤中减少第一链产物的量,减少引物的用量,减少,PCR,的循环次数,提高退火温度,提取高质量,RNA,，,防止被,DNA,污染,可能原因,解决方案,RT,常见问题分析和解决方案,4,、,DNA,鉴定,DNA,的鉴定,浓度鉴定,纯度鉴定,完整性鉴定,浓度鉴定,1,）紫外分光光度法：测定,DNA,在,A,260nm,的光吸收值。,如计算,DNA,浓度,A,260,稀释倍数,50,g/ml,紫外分光光度法只用于测定浓度大于,0.25ug/ml,的核酸溶液。,(,A,值等于,1,时，相当于,50,g/ml,双链,DNA,，,40,g/ml,单,链,DNA,或,RNA,，,20,g/ml,单链寡核苷酸）,各种碱基的紫外吸收光谱,2,）荧光光度法,荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。,适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（,1-5ng,）,EB,与,DNA,的结合,500,l,全血提取的基因组,DNA,电泳,动物组织提取基因组,DNA,纯度鉴定,紫外分光光度法：,在,260nm,和,280nm,处测定,DAN,溶液的光吸收，纯的,DNA,，,低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此值表明有,RNA,的残留量。,A,260,与,A,280,之比应在,1.80,；纯的,RNA A,260,与,A,280,之比应在,2.0,。,A260/A280,比值是纯度检测的重要指标。,完整性鉴定,凝胶电泳法：,基因组,DNA,电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象；,总,RNA,电泳，观测各条带的含量，提示是否存在,RNA,降解；如加样槽中存在条带，可能是,DNA,污染。,核酸电泳,1.,应与进行普通微生物实验的区域分离好,2.,使用标有,“,无,RNA,酶,”,的商品试管,吸头,溶液和水,.,通常新的无菌处理过的塑料试管和吸管无,RNA酶,3.,双蒸水,(ddH2O),和溶液应该用,RNA,酶的抑制剂,DEPC(,焦碳酸二乙酯,),进行处理,:,每,100mL,溶液或水中加入,0.1mL DEPC,原液,放在摇床上充分混匀并在,37,下作用数小时,.,然后将溶液高压灭菌,15min,使,DEPC,失活,4.,分离,RNA,以前,将一些实验室玻璃制品置于烤箱在,300,烘烤,4h,以灭活核酶,.,如有可能,将其他设备也灭菌处理,前期准备,:,1.,在,Trizol,试剂的保护下，匀浆组织，静置裂解细胞释放内含,RNA,，,Trizol,试剂对,RNA,有保护作用，能抑制,RNA,酶的活性，并且同时有裂解细胞的作用。,2.,将匀浆液中加入苯酚，去除裂解液中的脂类，蛋白和,DNA,，离心后取出上清液，里面含有,RNA,，而杂志留在苯酚中。,3.,在上清液中加入等体积异丙酮，混匀后，静置片刻，离心，将,RNA,沉淀于管底。弃上清，用,75%,乙醇洗涤沉淀，离心。去上清，将沉淀在真空干燥器中烘干。,核酸电泳,带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为,电泳,(electrophoresis),。,各种生物大分子在一定,pH,条件下可以解离成带电荷的离子。在电场中会向相反的电极移动。,人们采用各种材料作为支持,电泳介质,创造出许多新方法其中以,琼脂糖,和,聚丙烯酰胺,为支持介质的凝胶电泳最为突出。,自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来按分子量大小分离,DNA,的凝胶电泳技术已经发展成为一种分析鉴定,重组,DNA,分子,及,蛋白质与核酸相互作用,的重要实验手段,凝胶电泳的原理：,当一种分于被放置在电场当中时、它们就会以一定的速度移向适当的电极。这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的,迁移率,。,它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。,也就是说电场强度越大电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度也就越快。反之则较慢。,电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。,由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等,降低了对流运动故已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数因此根据,分子大小的不同,、,构型,或,形状的差异,。以及,所带的净电荷,的多寡。便可以通过电泳将蛋白质或核园分子混合初中的各种成分被此分离开来。,1.,琼脂糖凝胶电泳,2.,聚丙烯酰胺凝胶电泳,3.,脉冲电泳凝胶电泳,琼脂糖,是一种从红色海藻产物琼脂中提取而来的线性多糖聚合物。当琼脂糖加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质琼脂糖由,1,3,连接的吡喃型,-D-,半乳糖与,1,4,连接的,3,6,脱水吡喃型,-L-,半乳糖组成。琼脂糖分子呈随机线团状，凝结初期由于氢键的作用形成双链分子，而后再发生双链分子间的连接直至最后固化。由于链间的连接是靠氢键的作用，所以一切会破坏氢键形成的因素都会影响凝胶的形成。,1.,琼脂糖凝胶电泳,根据琼脂糖的溶解温度，把琼脂糖分为一般,琼脂糖,和,低熔点琼脂糖,.,低熔点琼脂糖熔点为,62,65,，溶解后在,37,下维持液体状态约数小时，主要用于,DNA,片段的回收，质粒与外源性,DNA,的快速连接等,.,凝胶的分辨能力,凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小,浓度越高，孔隙越小,其分辨能力也就越,强,：,浓度降低孔隙就增大,其分辨力也就随之减,弱,。,凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关。琼脂糖凝胶分辨,DNA,片段的范围为,70bp-80kb,之间；而要分辨较小分子旦的,DNA,片段，则要用聚丙烯酰胺凝胶，其分辨能力为,6-1000bp,之间。,电泳时,DNA,迁移的影响因素,1.DNA,分子质量的影响,2.DNA,构型的影响 如：,质粒,超螺旋,DNA,线状,DNA,开环,DNA3.,胶浓度的影响,4.,电场强度的影响,5.EB,的影响,6.,电泳缓冲液的影响,7.,碱基组成与电泳温度的影响,EP,电泳缓冲液,1.TAE (,Tris,-,乙酸,),2.TBE (,Tris,-,硼酸,),3.TPE (,Tris,-,磷酸,),TBE,与,TPE,缓冲容量高,，,DNA,分离效果好，但,TPE,在,DNA,片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使,DNA,沉淀,.TBE,会引起高电渗现象。,TAE,缓冲容量低，,但价格较便宜，因而推荐选用,TBE.,缓冲液中的,EDTA,可螯合 二价阳离子，从而抑制,DNA,酶的活性，防止,PCR,扩增产物降解,.,电泳电压,一般电压为,1-10V/cm,。对大分子的分离可用电压,5V/cm,以下,。电泳过程最好 在低温条件下进行。,琼脂糖电泳的用途,判断扩增片断的大小,回收扩增片断,用于转印进行,Southern,印迹,问题,如何获得清晰的琼脂糖电泳照片呢？,琼脂糖电泳结果的影响因素,凝胶,电泳液,电压,检测手段,琼脂糖凝胶浓度的选择,1,、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 在凝胶中，,DNA,片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比。,2,、琼脂糖凝胶电泳分离,DNA,时分子大小不宜超过,20kb,。,3,、,不同大小的,DNA,需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖浓度与,DNA,分离范围,琼脂糖浓度,/%0.30.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0,线状,DNA,大小,/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1,电泳缓冲液,DNA,的泳动受到电泳缓冲液和离子浓度的影响。,缺乏离子，电导率严重降低，电泳迁移率很慢；离子强度过高，电导率升高，极易产生大量的热能，最严重的结果是凝胶熔化，,DNA,变性,常用的电泳缓冲液有,TAE,，,TPE,和,TBE,其中,TAE,的缓冲容量最低，长时间电泳将被消耗。,电泳缓冲液比较,缓冲液,缓冲容量,迁移速度,分辨率,用途,TAE,最低,最,快,(,高,10,),高分子量高,高度复杂,DNA,混合物；超螺旋,DNA,TBE,很高,较慢,低分子量高,价格昂贵，,但推荐使用,TPE,琼脂糖凝胶中,DNA,的检测,凝胶中核酸染色方法：,溴化乙锭,(EB),染色法和,SYBR Gold,染色法,前者检测灵敏度低,10ng,，,但价格便宜，常用,后者检测灵敏度高,20pg,，,但价格昂贵，不常用,染料存在时，线状,DNA,电泳迁移率降低约,15,在凝胶中没有,EB,时，,DNA,条带更为清晰，当需要知道,DNA,片断的准确大小时，可以在无,EB,情况下电泳，电泳结束后用,EB,染色,染色方法：将凝胶浸入含有,EB(0.5ug/ml),的电泳液中，室温下,30-45min,。,染色完毕后通常不需要脱色。在检测小量,DNA(10ng,以上量的,DNA,条带,.,要求更高 的灵敏度，可用银染,.,同浓度丙烯酰胺和,DNA,的 有效分离范围（表,3,）,丙烯酰胺,(%),有效分离范围,(,bp,),溴酚兰,*,二甲苯青,*,3.5,100,2000,100,460,5.0,80,500,65,260,8.0,60,400,45,160,12.0,40,200,30,70,15.0,25,150,15,60,20.0,10,100,12,45,*表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链,DNA,分子所含碱基对数目,(,bp,).,DNA,染色,:,a.,溴化乙锭,(,Ethidium,bromide,，,EB),在凝放电泳中，加入溴化乙锭染料对核酸分子染色之后,(,凝胶电泳液中加入终浓度为,0.5ug/ml,的,EB),。将电泳标本放置在紫外光下观察便可以十分敏感而方便地检测出凝胶介质中,DNA,的谱带部位即使每条,DNA,带中仅含有,0.05ug,的微量,DNA,也可以被清晰地段现出来。,溴化乙锭是一种具扁平分子的核酸染料可以插入列,DNA,或,RNA,分子的碱基之间。并在,302nm,波长的紫外光照射下有最大红色荧光,(590nm),发出。,EB,的突出缺点：,为中度毒性的强诱变剂,(302nm,透照，,254nm,外照,),电泳载样缓冲液,(Loading buffer):,核酸电泳常用的指示剂有,溴酚兰,和,二甲苯青,及银染色,.,溴酚兰,在碱性液体中呈紫兰色，在,0.6%,、,1%,、,1.4%,和,2%,琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与,1Kb,、,0.6Kb,、,0.2Kb,和,0.15Kb,的双链线性,DNA,片段大致相同,.,二甲苯青,的水溶液呈兰色，它在,1%,和,1.4%,琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与,2Kb,和,1.6Kb,的双链线性,DNA,大致相似,.,指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖,400,组成,载样缓冲液,载样缓冲液的作用有,:,增加样 品密度，使其比重增加，以确保,DNA,均匀沉入加样孔内,;,在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可预测核酸电泳的速度和位置,;,使样品呈色，使加样操作更方便,.,b.,银染色,:,银染色液中的银离子,(Ag+),可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使,Ag+,还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色。,主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色，其灵敏度比,EB,高,200,倍,.,但银染色后，,DNA,不宜回收,.,c.SYBR,Green I,A,minor groove,binding dye,Initial Phase,Exponential Phase,Plateau Phase,3.,脉冲电泳凝胶电泳,(,Pulsed field gel electrophoresis,，,PFGE),在电场的作用下,DNA,可进入较小的琼脂糖凝胶孔中，大的分子只能进入大的胶孔，但需要较长的时间方能找到可进入的胶孔，所以泳动轨迹弯曲，速度缓慢。,大于,30kb,和,DNA,分子在电泳中只能头尾牵引进入胶孔，需定期改变电场方向使大分子通过凝胶孔。,每改变一次大的伸展的,DNA,分子重新定向，在新的方向上通过凝胶。通过不断交替改变电场方向，选择恰当的脉冲时间等条件，可将,35,10000kb,的,DNA,分子在凝胶中予以分辨。,像大肠杆茵这样的原核生物,其染色体基因组,DNA,的长度超过,4000kb,。,哺乳动物主要组织相容性基因座,(locus),所占的,DNA,长度亦达数千,kb,。,由此可见,运用普通的凝胶电泳技术显然是无法分离如此超大分子量的,DNA,分子的。,1984,年,D.C.Schwartz,和,C.R.Cantor,发明的脉冲电场凝胶电泳,(PFGE),技。可以成功地用来分离整条染色体这样的超大分子量的,DNA,分子。,在标准的脉冲电场凝胶电泳中、头一个脉冲的电场方向与核酸移动方向成,45,度夹角，而下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧亦成,45,度夹角。,由于加压在琼脂糖凝胶上的电场方向、电流大小及作用时间都在交替地变换着，使得,DNA,分子能够随时地调整其游动方向，以适应凝胶孔隙的无规则变化。与分子量较小的,DNA,分子相比、分子量较大的,DNA,分子需要更多次地更换其构型和方位，以使其可以按新的方向游动。,因此，在琼脂糖介质中的迁移速率显得更慢一些，从而达到了分离超大分子量,DNA,分子的目的。,Contour-clamped homogeneous electric field(CHEF),(,Chu,et al.,1986,1990),Increased separation of the 20-50 kb range with field inversion gel electrophoresis(FIGE),钳位均匀电场凝胶电泳,倒转电场凝胶电泳,