蛋白质理化性能与纯化.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,第六节,蛋白质的理化性质与分离纯化,The Physical and Chemical Characters and Separation and Purification of Protein,一、理化性质,（一）蛋白质的两性电离性质,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液,pH,条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,*蛋白质的等电点,(,isoelectric,point,pI,),当蛋白质溶液处于某一,pH,时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的,pH,称为,蛋白质的等电点,。,（二）蛋白质的胶体性质,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自,1,万至,100,万或更大，由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。其分子的直径可达,1,100nm,，为胶粒范围之内。,蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。,由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。,*蛋白质胶体稳定的因素,:,颗粒表面电荷、水化膜,+,+,+,+,+,+,+,带正电荷的蛋白质,带负电荷的蛋白质,在等电点的蛋白质,水化膜,+,+,+,+,+,+,+,+,带正电荷的蛋白质,带负电荷的蛋白质,不稳定的蛋白质颗粒,酸,碱,酸,碱,酸,碱,脱水作用,脱水作用,脱水作用,溶液中蛋白质的聚沉,（三）很多因素可引起蛋白质的变性,*蛋白质的变性,(,denaturation,),：,在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失；,*,变性后的蛋白质称为,变性蛋白,；,造成变性的因素,温度（热、,冷,）加热；,强酸、强碱；,尿素和盐酸胍的影响（破坏分子内部氢键、破坏疏水效应）；,表面活性剂的影响：如十二烷基硫酸钠（,SDS,）,等,变性的本质,破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。,临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。,食品方面；蛋白质制备；酶制剂保存等；,此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,应用举例,复性,(,renaturation,),若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为,复性,；,类型：不可逆变性、可逆变性（可复性）。,尿素、,-,巯基乙醇,去除尿素、,-,巯基乙醇,天然状态，有催化活性,非折叠状态，,无活性,（四）蛋白质的沉淀作用,蛋白质沉淀,在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而蛋白质从溶液中析出；,变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性；蛋白质的凝固作用,蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中；,蛋白质的沉淀分为可逆沉淀和不可逆沉淀,。,1,、可逆沉淀,在温和条件下，通过改变溶液,的,pH,或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中,沉淀分离,。,在沉淀过程中，,结构和性质,都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为,非变性沉淀,。,可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。,盐析,法：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠）使蛋白质沉淀析出的现象（,水与离子的相互作用增加了蛋白质表面的疏水补丁的相互作用；同时瓦解了以电荷为基础的蛋白质分子之间的作用,）。,盐溶：,低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，此现象叫盐溶。,等电点沉淀法,（,脱去水化层、降低介电常数）,。在低温下或缩短处理时间可防止或减缓变性。,有机溶剂沉淀法,2,、不可逆沉淀,在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。,由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。,如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀,。,（五）蛋白质在紫外光谱区有特征性吸收峰,大部分蛋白质均含有带芳香环的,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸,。,这三种氨基酸的在,280nm,附近有,最大吸收,。因此，大多数蛋白质在,280nm,附近显示强的吸收；,蛋白质的,OD,280,与其,浓度,呈正比关系，可以对蛋白质进行定性鉴定和定量测定。,（六）蛋白质的呈色反应可用于溶液蛋白质测定,蛋白质经水解后产生茚三酮反应,蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应,(,ninhydrin,reaction),。,肽链中的肽键可与双缩脲试剂反应,蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为,双缩脲反应,(,biuret,reaction),，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。,二、蛋白质的分离和纯化,纯化的目标,尽量提高蛋白质的,纯度,或,比活性,，设法除去变性的和不需要的蛋白质，尽可能提高蛋白质的产量。,（一）蛋白质分离纯化的一般原则,1,）从组织细胞中溶解放出蛋白质,，并保持天然状态，常用低温冰冻、化学试剂及溶菌 酶破壁、破膜，再用溶剂提取。,2,）分离所需要蛋白质与其他蛋白质,a,等电点沉淀,b,盐析和有机溶剂分级分离,1,、天然蛋白质的分离,4,）结晶提纯,a,多次结晶，除杂蛋白和变性蛋白；,b,结晶的最佳条件：略过饱和溶液；,各步骤要求条件温和，并加少量杀菌剂。,防止蛋白质变性、蛋白质酶作用及微生物污染。,3,）纯化：,a,离子交换层析,b,凝胶过滤层析,c,亲和层 析,d,电泳方法,e,疏水相互作用色谱,（二）透析及超滤法,*透析,(dialysis),利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。,*超滤法,应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,透析的示意图,（三）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀,*,使用,丙酮沉淀,时，必须在,0,4,低温下进行，丙酮用量一般,10,倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,*盐析,(salt precipitation),是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。,将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。,免疫沉淀法（,immunoprecipitation,),（四）利用荷电性质可将蛋白质采用,电泳法进行分离,蛋白质在高于或低于其,pI,的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为,电泳,(,elctrophoresis,),。,根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。,*,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳,(SDS-,polyacrylamide,gel,electrophoresis,，,SDS,-PAGE),常用于蛋白质分子量的测定,;,*,等电聚焦电泳,(,isoelectric,equilibrium,electrophoresis,IEE,),，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法,;,*,双向凝胶电泳,(two-,dimentional,gel,electrophoresis,2-DGE),是蛋白质组学研究的重要技术。,几种重要的蛋白质电泳,电泳上样和电泳图,走电泳,蛋白质在等电点,pH,条件下，不发生电泳现象。,利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。,M,SDS-15%PAGE,大肠杆菌发酵产物的电泳,（五）应用相分配或亲和原理可将蛋白质进行层析分离,层析或色谱,(chromatography),分离蛋白质的原理,待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。,离子交换色谱,（,ion exchange chromatography,IEC,),；,凝胶过滤,(,gel filtration,),又称分子筛层析,(,molecular sieve filtration,),或体积排阻色谱（,steric,exclusion chromatography,）；,疏水相互作用色谱,（,Hydrophobic Interaction Chromatography,，,HIC,）；,亲和色谱,（,Affinity Chromatography,，,AFC),。,蛋白质分离常用的色谱方法,IEC,是,利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离,凝胶过滤或体积排阻色谱（,SEC,）或分子筛层析,(,molecular sieve filtration),是利用各蛋白质分子大小不同分离；,HIC,是,基于用适度疏水性的固定相，以含盐的水溶液作为流动相分离；,AFC,是基于固定相的配基与生物大分子之间的特殊的生物亲和能力的不同来进行生物大分子相互间的分离。,常用的配基有抗体、抗原、激素或受体蛋白、酶的底物和抑制剂等。层析柱载体为琼脂糖凝胶等。,（六）利用蛋白质颗粒沉降行为不同可进行超速离心分离,*,超速离心法,(ultracentrifugation),既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。,*蛋白质在离心场中的行为用,沉降系数,(sedimentation coefficient,S),表示，沉降系数与蛋白质的密度和形状相关。,离心机和离心沉降法分离蛋白质,分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成,测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基,把肽链水解成片段，分别进行分析,测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用,Edman,降解法,一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。,（七）用化学或反向遗传学方法可分析多肽链中氨基酸序列,通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列,按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列,分离编码蛋白质的基因,测定,DNA,序列,排列出,mRNA,序列,氨基酸和肽末端测定法,离子交换色谱分析蛋白质的氨基酸组分,（八）应用物理学、生物信息学原理可进行蛋白质空间结构测定或预测,1.,二级结构测定,通常采用圆二色谱（,circular,dichroism,CD,),测定,溶液状态,下的蛋白质二级结构含量。,a-,螺旋的,CD,峰有,222nm,处的负峰、,208nm,处的负峰和,198nm,处的正峰三个成分；而,b-,折叠的,CD谱不很固定。,2.,三维空间结构测定,X,射线衍射法,（,X-ray diffraction),；,核磁共振技术（,nuclear magnetic,resonance,NMR,),这两种方法是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。,3.,根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构,用,分子力学,、,分子动力学,的方法，根据物理化学的基本原理，从理论上计算蛋白质的空间结构；,通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于,新的蛋白质空间结构预测,。,三、蛋白质的分析测定,1,凯氏定氮法：,a 19,世纪丹麦化学家凯道尔所创造的方法，之后 又出现了一系列的改良凯氏法,;,b,将样品蛋白质的,N,经消化全部转变为无机氮，测定,N,的含量，得到蛋白质的含量。,2,双缩脲法,在强碱性溶液中，蛋白质与,CuSO,4,反应，生成紫红色化合物是，其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质分子量和,AA,组成无关。,(,一）含量的测定,3,福林,酚试剂法,a,福林,酚试剂包括两组试剂：碱性铜试剂和磷钼酸和磷钨酸的混合试剂,;,b,碱性铜试剂与蛋白质产生双缩脲反应,;,c,反应后的蛋白质的酚基在碱性条件将磷钼酸和磷钨酸还原为蓝色的钼蓝和钨蓝，蓝色的深浅与蛋白含量质成正比。,4,紫外线吸收法,蛋白质中的,Tyr,、,Try,在,280nm,左右具最大吸收，且在各种蛋白质中,Tyr,、,Try,含量差别不大，,280nm,吸收值与浓度具正相关。,1,、,常用聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳法,;,2,、,高纯度：电泳得到均一的一条区带,;,低纯度：电泳得到几条区带,;,（二）蛋白质纯度的鉴定,1,、,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳法测相对分子量,a,电泳中加入,SDS,（,十二烷基硫酸钠，其带的负电 荷量大大超过蛋白质分子电荷量），蛋白质分子的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。,b,在实际测定中用己知相对分子质量的单体蛋白质作标准，用,Mr,和实际迁移率作图，从图上求知,Mr,。,（三）蛋白质相对分子质量的测定,2,凝胶过滤法测相对分子质量,a,依据蛋白质大小分离蛋白质,b,不同,Mr,洗脱体积,Ve,不同，在一定条件下：,lgMr,=K,1,K,2,Ve,c,用己知和蛋白质作标准，求出,K,1,、,K,2,d,由待测样在同一凝胶柱上的,Ve,，,求出其,Mr,e,要求样品与标准蛋白质具有相同分子形状。,