第三讲 技术方法(一).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三讲 环境生物技术研究方法,环境生物技术,Environmental biotechnology,(,一,),第一节 传统微生物分析方法,主要内容,第二节 现代微生物分析方法,第一节 传统微生物分析方法,一,.,显微直接计数法,利用血球计数板在显微镜下直接测定。观察一定容积中微生物个体数目，然后推算出含菌数（包括死活细胞、微小杂物）。,结果往往偏高。常用于形态个体较大的菌体或孢子,1mm,1mm,二,.,平板计数法,目的,想知道待检测样品中的微生物数量,原理,根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。,菌落总数：,指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、,pH,、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的微生物菌落总数。,菌落总数,并不表示实际中的所有微生物,总数,，菌落总数并不能区分其中微生物的种类，所以有时被称为杂菌数。,操作程序,首先将待测样品制成均匀的一系列不同稀释液，并尽量使样品中的微生物细胞分散开来，使成单个细胞存在，再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经过培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。,平板倾注法,先把适量稀释液,1mL,),移进灭菌培养品，再倒入已融化并冷却至,45,50,的培养基，轻轻转动平板，使稀释液与培养基混合均匀，冷凝后倒置，适温培养。,平板表面涂布法,先将融化的培养基凝固，再移入适量稀释液（,0.2mL,），然后用涂布刀涂布于整个平板的表面，放置片刻,(,约,l0min),，将平板翻转,适温培养。,操作方法,平板表面点滴法,与涂布法相似，用标定好的微量吸管或注射器针头按滴,(,使每滴相当于,0,025mL),将检样稀释液滴加于琼脂平板上固定的区域,(,预先在平板背面用标记笔划成四个区域,),，每个区域滴,1,滴，每个稀释度滴两个区域，作为平行试验。滴加后，将平板放平片刻,(,约,5,10min),，然后翻转平板，,适温培养。,主要工具,细菌,:,牛肉膏蛋白胨培养基,牛肉膏：,3g,水：,1000ml,蛋白胨：,5g,琼脂：,18g,pH,：,7.0-7.2,放线菌,:,改良高氏,1,号培养基,KNO,3,：,1.0g,水：,1000ml,K,2,HPO,4,：,0.5g,淀粉：,20g,MgSO,4,7H,2,O,：,0.5g NaCl,：,0.5g,FeSO,4,7H,2,O,：,0.5g,琼脂：,18g,真菌,:,马丁培养基,KH,2,PO,4,：,1.0g,葡萄糖：,10g,MgSO,4,7H,2,O,：,0.5g NaCl,：,0.5g,琼脂：,18g,水：,1000ml,3.3ml 1%,孟加拉红,/1000ml,0.3ml 1%,链霉素,/100ml,通常情况下的稀释度,细菌：,10,-4,10,-6,真菌：,10,-1,10,-3,放线菌：,10,-3,10,-5,培养：,28,30,细菌：,3,5,d,真菌：,5,7,d,放线菌：,10,14d,2,3d,3 5d,5 7d,20,200,10-100,20-200,注意事项,（,1,）,样品稀释,时,尽量使样品中的微生物细胞分散开，,以,单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞）,（,2,）接种量要准确,（,3,）涂布要均匀,使用范围,一般用于土壤、水源,、大气、食品等,的污染程度检验,三,最大或然数法（,MPN,）,目的,计数待测样品中的特殊功能微生物数量；检测样品中特殊微生物功能是否存在,最大或然数,(mostprobablenumber,，,MPN),计数又称稀释培养计数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。,其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。,原理,将待测样品作一系列稀释，一直稀释到将少量（如,lmL,）的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖。根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度，采用“最大或然数”理论，可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值,.,操作程序,10,-2,10,-3,10,-4,10,-5,10,-6,1ml,9ml,稀释度,10,-1,10,-2,10,-3,10,-4,10,-5,生长情况,5,5,5,5,5,5,5,4,2,0,542,举例,重复管数,544,10,-1,10,-2,10,-3,10,-4,10,-5,5,4,2,2,0,稀释度,生长情况,数量指标,细菌近似值,数量指标,数量指标,数量指标,数量指标,000,0.0,101,130,212,543,001,0.2,102,131,220,544,010,0.4,103,140,221,545,011,0.2,110,200,222,550,012,0.6,111,201,230,551,020,0.4,112,202,231,552,021,0.6,120,203,240,553,030,0.6,121,210,300,554,100,0.2,122,211,301,555,五次重复测数统计表,结果计算：,每个干土中菌数,=,近似值,数量指标第一位数稀释倍数,干土,%,适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群,特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度,适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等,),注意,（,1,）菌液稀释度要合适。原则是最低稀释度的所有重复都应有菌生长，而最高稀释度的所有重复无菌生长。,（,2,）每个接种稀释度必须有重复，重复次数可根据需要和条件而定，一般,35,个重复，但重复次数越多，误差就会越小，相对地说结果就会越正确。,四,.,微生物生物量碳,氯仿熏蒸培养法、,氯仿熏蒸浸提法（去乙醇氯仿）,原理,：将土壤经过氯仿熏蒸后，在好气条件下培养（,10d,），然后测定培养期间,CO,2,的释放量，根据,CO,2,的增量计算土壤中的微生物生物量碳。,培养法,培养时间过长，不适合快速测定,不适合强酸性土壤的测定,不适合风干土,不适合添加有新鲜有机质的土壤,缺点,原理,：土壤经氯仿熏蒸处理，微生物被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中可提取碳、氨基酸、氮、磷和硫等大幅度增加，通过测定浸提液中全碳的含量可计算微生物生物量碳,浸提法,样品立即除去植物残体、土壤动物，土壤太湿需要阴凉处凉干,抽提真空时防爆；培养过程防漏气；氯仿蒸汽要饱和；保持湿度；暗处培养,提取充分,注意,六,.,呼吸法,密闭容器法、华勃检压法、呼吸仪法、基质诱导呼吸法（,SIR,）等,五,.,微生物酶法,脲酶、磷酸酶、脱氢酶、过氧化氢酶,自然样品中可培养的微生物占可数微生物的比例,第二节 现代微生物分析方法,基于,PCR,反应的微生物分析方法（,PCR-DGGE,）,基于生物标记的微生物分析方法（,PLFA,）,基于碳利用方式的微生物分析方法（,BIOLOG,）,基于免疫技术的微生物分析方法（,ELISA,）,基于原位杂交反应的微生物分析方法（,FISH,）,基于稳定同位素探针,-,核酸微生物分析技术（,SIP-DNA,SIP-RNA,SIP-PLFA,）,PCR,介绍,PCR,（,Polymerase Chain Reaction,）,：即聚合酶链式反应，是,20,世纪,80,年代中期（,1985,）发展起来的一项,体外快速核酸扩增,技术，其基本原理类似于,DNA,的天然复制过程。,它通过与目的基因两端互补的寡核苷酸引物，经,“,变性,-,退火,-,延伸,”,三个基本反应步骤完成对靶序列的扩增。,1.PCR,原理,DNA,模板在高温下变性，,DNA,解链成单链，当温度降低时，人工合成的两个寡核苷酸引物在合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，在,DNA,聚合酶作用下，随着温度的缓慢提升，引物逐渐延伸，两条引物之间的区域被合成，完成一个循环，然后,DNA,再次被变性，进入下一个循环。,凝胶成像系统,2.PCR,的反应流程,预变性：,94,，,2min;,P,1,P,2,退火,延伸,变性,P,1,P,2,P,1,P,2,30-35Cycles,94,，,30s,T,m,-5,，,30s,72,，,1-2kb/min,循环,补充延伸：,72,，,5-10min.,5,3,3,5,5,3,3,5,3,5,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,3,5,3,5,3,5,5,3,5,3,5,3,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,3,5,3,5,特异性强,:,可以从成千上万个基因中对某个特定基因进行扩增。,高效快速,:,可将所要研究的目的基因或某一,DNA,片段于数小时内扩增至百万倍以上,使肉眼能直接观察和判断。,灵敏度高,:,可以从微量的样品中扩增出足量的,DNA,供分析研究和检测鉴定。,重复性好,:,在体系稳定的情况下，对某个特定基因的扩增不会受时空和操作主体变化的影响。,易自动化,:,只要编写一个程序，仪器就可自动完成整个扩增过程。,3.PCR,的特点,4.PCR,的反应体系,模板,引物,耐热聚合酶,dNTP,二价阳离子,反应缓冲液,水,一,.,模板,模板可以是,DNA,，也可以是,RNA,当用,RNA,做模板时，先经过反转录生成,cDNA,现在用的,PCR,酶都仅识别,DNA,，不能识别,RNA,扩增是成对扩增,RNA,易降解，,RNA,酶存在广泛，活性稳定,选择,16S rRNA,的原因,核糖体,rRNA,的保守性和可变性,长度和信息量适中,(50,个功能域,),有重要的功能（蛋白质合成开始有关）,有比较完善的,16S rRNA,数据库,用的最多的是原核生物的核糖体,16S rRNA,rDNA,和,rRNA,中的,r,”,是,ribosome(,核糖体,),的缩写。,rDNA,指的是基因组中编码核糖体,RNA,（,rRNA,）分子的对应的,DNA,序列，也就是编码,16S rRNA,的基因。,rRNA,指的是,rDNA,的转录产物，它是构成核糖体的重要成分，核糖体由许多小的,rRNA,分子组装而成，,16S rRNA,是其中一个组件,.,一般所分析的对象都是,16S rDNA,，因为,DNA,提取容易，也比较稳定,16S rDNA,与,16S rRNA,的区别,提取,利用,DNA,和蛋白质对提取过程中各种试剂不同的反应和溶解性来达到分离目的,方法,细胞提取法,：,DNA,纯度较高，但提取效率较低，操作烦琐,直接溶解法,：操作简单，效率高，但获得的,DNA,纯度不够，需要进行纯化处理,原理,物理法,：玻璃珠匀浆法、超声震荡法、反复冻溶法、研磨法,化学法,：表面活性剂（,SDS,）,生物法,：酶解,细胞破碎,物理法,：,DNA,分子断裂,化学法,：对细胞壁厚的细菌比较困难,常用：酶解,+SDS,利用苯酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性,氯仿加速有机相与水相分离,SDS,将细胞膜裂解，在蛋白酶,K,的作用下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核酸蛋白质变性降解，使,DNA,从核蛋白中游离出来,异戊醇,作用是消除抽提过程中产生的泡沫,经典提取方法（苯酚,/,氯仿有机提取法）,为什么土壤样品需要纯化模板？,有机质（如腐殖质）,重金属,纯化方法,商业化的核酸纯化试剂盒,传统方法（乙醇,-,醋酸钠）,注意！,纯 度：,杂蛋白、多糖、酚类,复杂性：,质粒、原核基因组,DNA,、真核基,因组,DNA,完整性：,降解,污 染：,有扩增产物的污染,数 量：,适中,二,.,引物,引物是,PCR,特异性反应的关键，,PCR,反应的特异性取决于引物与模板,DNA,的互补程度。,了解要扩增片段的,DNA,序列,找到,DNA,序列的保守区并具有特异性（非特异扩增区序列的同源性小于,70%,避开能形成二级结构的区域,引物设计,引物长度,:10,30 bp,过短：特异性差,过长：导致延伸温度大于,74,，不适于,Taq,DNA,聚合酶进行反应（大于,38bp,）,碱基分布,:A,、,T,、,G,、,C,随机分布,引物的设计原则,G+C,含量,：,40,%,60%,，,过高或过低都不利于引发反应。有效引物的,Tm,为,5580,，,Tm,最好在,72,左右,引物间,：不能有连续,4,个碱基互补,引物,5,末端碱基,:,可不与模板,DNA,互补，可做修饰，但,3,不可修饰，,因为引物的延伸是从,3,端开始的,引物,3,末端碱基,：最好选,T,，不选,A,，为,A,时即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而为,T,时错配的引发效率大大降低；出现,3,个以上的连续碱基，如,GGG,或,CCC,，也会使错误引发机率增加,引物自身,：不应形成二级结构,(,互补碱基小于,3bp),引物的使用,引物的浓度一般要求在,0.2,0.5,mol/L,低于,0.2,mol/L,:,产量下降,高于,0.5,mol/l:,促使错误引导及非特异性产物积累,;,易形成二聚体,;,这些会与靶序列竞争,DNA,聚合酶和,dNTPs,一般用,TE,配制成高浓度母液（,10,mol/L,），保存在,20,，使用前用,ddH,2,O,稀释成工作液。避免反复冻融，造成引物降解。冻干引物,20,下可保存,1224,个月，液体状态可以保存,6,个月,引物,1,引物2,注意！,纯 度：,混有短片段引物（纯化）,完整性：,避免反复冻融,污 染：,模板,DNA,三,.,耐热聚合酶,耐热聚合酶的选择非常重要，很大程度上关系到扩增的效率和特异性,1983,年，美国,PE-Cetus,公司使用大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,的,Klenow,片段（,37,）,1987,年，发现耐热性,DNA,聚合酶,Taq,pol,后，,PCR,反应特异性得到提高,Taq,pol,、,Pfu,、,HotStart,Taq,、,Taq,Plus,、,Long,Taq,，其中使用较多的是,Taq,DNA,聚合酶,主要耐热酶,Tap,pol,分离自美国黄石国家公园温泉中嗜热水生菌,Taq,pol,酶有较强的稳定性，在,92.5,、,95,、,97.5,时的半衰期分别为,130,、,40,、,5,6min,Taq,pol,酶有较高的催化活性，在所有的耐热,DNA,聚合酶中，催化活性最高，达,2,10,5,U/mg,最适催化温度为,75,80,，延伸速率约为,150,300,个核苷酸,/,（秒,酶分子）,（,1,）需要提供合成模板,（,2,）不能起始新的,DNA,链，必须要有引物提供,3,OH,（,3,）合成的方向都是,5 3,（,4,）除聚合,DNA,外还有其它功能。,DNA,的聚合酶特点,注意！,纯 度,:,宿主菌,DNA,污染、宿主蛋白,酶 量：,适量（,2.5U/100ul,），过高，非特异性扩增；过低，合成产物量少,反应缓冲液：,匹配,不同,DNA,聚合酶,PCR-DGGE,结果,成分,:,Tris-HCl,、,K,、,增强剂、稳定剂,（,Mg,2+,）,(,三羟甲基氨基甲烷,),浓度,四,.,反应缓冲液,10mmol/L,pH 8.3,（,25,）,优点：,Tris,碱的碱性较强，所以可以只用这一种缓冲体系配制,pH,范围由酸性到碱性的大范围,pH,值的缓冲液；对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。,为什么使用,Tris-HCl,缓冲液,缺点：缓冲液的,pH,值受溶液浓度影响较大，缓冲液稀释10倍，,pH,值的变化大于,0.1,；温度效应大，温度变化对缓冲液,pH,值的影响很大（,4,时,8.4,，,37,时,7.4,），一定要在使用温度下进行配制；易吸收空气中的,CO,2,，配制的缓冲液要盖严密封；对某些,pH,电极发生一定的干扰作用，所以要使用与,Tris,溶液具有兼容性的电极。,五,.,二价阳离子,Mg,2+,是,PCR,反应的稳定剂，是耐热聚合酶的重要影响因子，对,PCR,产物的特异性及产量有显著影响,Mg,2+,浓度过低，会降低,Taq,DNA,酶的活性，产物下降；,Mg,2+,浓度过高，会使反应特异性降低,Mg,2+,浓度,1.5,2.0mmol/L,为宜，因为,DNA,模板、引物和,dNTP,均可与,Mg,2+,结合,六,.dNTP,dNTP,是,PCR,反应的原料，其浓度与质量和,PCR,反应效率有密切关系,dNTP,使用浓度过高易产生错误掺入，或得不到扩增产物，过高,dNTP,浓度还可能导致,Mg,2+,浓度下降,使用浓度过低，,PCR,产物下降,一般常用,dNTP,终浓度以,50,200,mol/L,为宜,四种脱氧核苷酸的浓度应相同，如果其中一种,dNTP,偏高或偏低，会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应,避免反复冻溶（易降解）,最好用,buffer,溶解,pH:,PCR,反应所需的,pH,通常在,8.09.0,之间,污染：,DNA,污染,七,.,水,5.PCR,产物检测,PCR,反应后期扩增产物已不再呈指数方式增加，而趋于一条平线，如果继续扩增，将会出现大量非特异性的产物，这就是所谓的平台效应,dNTP,、酶、引物、镁离子浓度下降,聚合酶酶活在数次高温后活性下降,产物浓度过高影响,PCR,反应,原因,凝胶电泳法,实时荧光定量,PCR,技术,定性及定量方法,大片段分子量大，在电泳速度慢，而小片段则相反，迁移速率快。根据凝胶电泳中条带的位置，可以判断,PCR,扩增产物的大小。,（,1,）凝胶电泳法,种类,琼脂糖凝胶电泳,是实验室最常用的,PCR,检测方法，操作简便，仅需要少量的扩增产物即可进行检测，范围,100,10000bp,，精度稍差,聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高，长度仅差,0.2%,的,DNA,分子即可被分开；能够装载,DNA,的量远大于琼脂糖凝胶电泳；从凝胶中回收的,DNA,纯度高,琼脂糖凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳,溴化乙锭,(EB),是一种荧光染料，,EB,分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为,0.5,g/ml,的,EB,（迁移率降低近,15%,），亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色,10,15min,。,染色观察,EB,见光分解,EB-DNA,的,EB,发出的荧光比游离的凝胶中的,EB,荧光强度大,10,倍，无需洗背景,可诱发突变,具有潜在致癌性,且具有中等毒性EB,替代品,GoldView(GV),是一种可代替溴化乙锭（,EB,）的新型核酸染料，灵敏度与,EB,相当，使用方法与之完全相同，在,100ml,琼脂糖胶溶液中加入,5,l GoldView,即可。在紫外透射光下双链,DNA,呈现绿色荧光，也可用于染,RNA,。,荧光颜料：,GeneFinder,、,SYBR Green,、,Gelstar,、,SYPRO Orange,、荧光素、绿色荧光蛋白等,银染色,:,银染色液中的银离子,(Ag,+,),可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂（如甲醛）使,Ag,+,还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色。其灵敏度比,EB,高,200,倍。但银染色后，,DNA,不宜回收。,Agarose Gel Electrophoresis,（2）实时荧光定量,PCR,技术,(Real-time Quantitative PCR),在,PCR,反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个,PCR,进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,扩增曲线图：,横坐标：,扩增循环数（,Cycle,）,纵坐标：,荧光强度,每个循环进行一次荧光信号的收集,荧光基团,荧光检测元件,实时荧光定量,PCR,原理,-,扩增曲线,实时荧光定量,PCR,原理,荧光信号的域值（,threshold,）,荧光本底信号（,baseline,）,C,T,值,背景信号阶段,信号指数扩增阶段,平台期,基线范围,:,从第,3,个循环起到,C,T,值前,3,个循环止，其终点要根据每次实验的具体数据调整，一般取第,3,15,个循环之间。早于,3,个循环时，荧光信号很弱，扣除背景后的校正信号往往波动比较大，不是真正的基线高度；而在,C,T,值前,3,个循环之内，大多数情况下荧光信号已经开始增强，超过了基线高度，都不宜当作基线来处理,阈值,:,基线范围内荧光信号强度标准偏差的,10,倍,基线,:,在,PCR,反应最初循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线,C,T,值：,是,PCR,扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数,基线上方产生可检测到的统计学上显著的荧光发射时所对应的,PCR,循环次数,C,T,值则极具重现性,C,T,值取决于阈值，阈值取决于基线，基线取决于实验的质量,实时荧光定量,PCR,原理,-,荧光定量原理,模板,DNA,量越多，荧光达到域值的循环数越少，即,C,T,值越小,LogDNA,浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品,C,T,值，就可以计算出样品中所含的模板量,实时荧光定量,PCR,原理,-DNA,产物的荧光标记,非特异性荧光标记：,1,、,SYBR Green,特异性荧光标记：,2,、,TaqMan,3,、,Molecular Beacon,4,、,Amplisensor,Q,Q,R,SYBR Green,法,-,工作机理,SYBR Green,能结合到双链,DNA,的小沟部位,SYBR Green,只有和双链,DNA,结合后才发荧光,变性时，,DNA,双链分开，无荧光,复性和延伸时，形成双链,DNA,，,SYBR Green,发荧光，在此阶段收集荧光。,模板：,6,个样品,只改变,SYBR Green,浓度,SYBR Green,浓度：,3,个浓度,C1,C2,C3,C2,C1,C3,SYBR Green,法,-,优缺点,对,DNA,模板没有选择性,-,适用于任何,DNA,使用方便,-,不必设计复杂探针非常灵敏,便宜,优 点,容易与非特异性双链,DNA,结合，产生假阳性（引物二聚体、单链二聚体、错配），,但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件,对引物特异性要求较高,缺 点,实时荧光定量,PCR,方法,2-TaqMan,法,与目标序列互补,TaqMan-,水解型杂交探针,5,端标记有报告基团,(Reporter,R),，如,FAM,、,VIC,等,3,端标记有荧光淬灭基团,(Quencher,Q),探针完整，,R,所发射的荧光能量被,Q,基团吸收，无荧光，,R,与,Q,分开，发荧光,TaqDNA,聚合酶有,53,外切核酸酶活性，可水解探针,TaqMan,法,-,工作原理,每扩增一条,DNA,分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光,R,Q,5,3,5,3,Excitation,R,Q,Q,R,Q,R,Excitation,双标记探针（,Taqman Probe,）,5,TaqMan,法,-,优缺点,对目标序列的高特异性,-,阴性结果确定,设计相对简单,-,与目标序列某一区域互补,重复性比较好,优 点,只适合一个特定的目标,委托公司标记，价格较高,不易找到本底低的探针,缺 点,6.PCR,常见问题,无扩增产物,非特意性扩增,拖尾,假阳性,问题一 无扩增产物,现象,：,正对照有条带，而样品则无,模板,:,含有抑制物，含量低,该,Buffer,对样品不合适,引物设计不当或者发生降解,反应条件：退火温度太高，延伸时间太短,对,策,纯化模板或者使用试剂盒提取模板,DNA,更换,Buffer,或调整浓度,重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物,降低退火温度、延长延伸时间,可能原因,问题二 非特异性扩增,现象,：,PCR,扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。,引物特异性差,酶纯度不高,Mg,2+,浓度偏高,退火温度偏低,Buffer,不合适,循环次数过多,对,策,重新设计引物或者使用巢式,PCR,换用高纯度的酶,降低镁离子浓度,适当提高退火温度或使用二阶段温度法,更换,Buffer,减少循环次数可能原因,问题三 拖尾,现象,：产物在凝胶上呈,Smear,状态,酶量过多,模板不纯,循环次数过多,dNTP,、,Mg,2+,浓度偏高,退火温度偏低,Buffer,不合适,对,策,适量用酶,纯化模板,减少循环次数,适当降低,dNTP,和,镁离子,的浓度,适当提高退火温度,更换,Buffer,可能原因,问题四 假阳性,现象,：,空白对照出现目的扩增产物,靶序列或扩增产物的交叉污染,对,策,操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外,除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。,各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。,7.,注意事项,合理分隔实验室（标本处理、,PCR,反应液制备、,PCR,循环扩增、,PCR,产物鉴定区）,实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的,DNA,或,RNA,配制,PCR,反应的移液器和其它移液器分开使用。经常更换手套防止来自表皮的细胞污染,吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染,8.,提高,PCR,反应特异性的策略,策略一：巢式,PCR,（,Nest-PCR,）,两套引物，扩增两次,两套引物的,T,m,值和浓度均不相同，外部引物的,T,m,值比内部引物的高，而外部引物的浓度往往比内部引物的低,巢式,PCR,可以增加有限量靶序列（如稀有,mRNA,）的灵敏度，并且提高了困难PCR,的特异性。,巢式,PCR,一般,PCR,策略二：多重,PCR,（,mulitiplex PCR,）,多对引物同时扩增一份,DNA,模板,多重,PCR,的技术要素主要包括目的片段选择、引物设计、复性温度和时间、延伸温度和时间、各反应成分的用量,策略三：递减,PCR,（,TouchDown PCR,）,递减,PCR,通过在,PCR,的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。循环设在比估算的,Tm,高大约,5,的退火温度下开始，然后每个循环降低,1,到,2,直到退火温度低于,Tm 5,特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势,递减,PCR,对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用,策略四：热启动,PCR,（,HotStart PCR,）,Taq,DNA,聚合酶的最佳延伸温度在,72,，聚合酶在室温仍然有活性,在进行,PCR,反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物,热启动,PCR,即在反应体系达到一定温度后再启动,DNA,扩增的,PCR,主要方法,HotStart,Taq,酶,：,Taq,酶经过化学修饰后，酶活性被封闭，要在,94-95,加热数分钟才能回复正常活力开始反应,Platinum DNA,聚合酶,延缓加入,Taq,DNA,聚合酶手工热启动方法,用蜡防护层将镁离子或酶包裹起来，或者将反应成分（如模板和缓冲液）物理隔离开,策略五：使用,PCR,增强剂,甲酰胺、,DMSO,、甘油、甜菜碱等可作为,PCR,的增强剂,增强剂浓度要适当,机理：降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助,DNA,聚合酶延伸通过二级结构区,基于,PCR,的微生物分析方法,1.PCR-DGGE,（,PCR-,变性梯度凝胶电泳）方法,2.PCR-SSCP,（,PCR-,单链构象多态性）方法,3.PCR-RLFP(PCR-,限制性片段长度多态性）方法,1.,PCR-DGGE,（,PCR-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,）方法,最早用于基因点突变的检测。,Myuzer(1993),是第一个将,DGGE,用于分子微生物学研究领域的研究者。,目前主要用于微生物多样性检测、微生物鉴定、微生物分子变异、种群异化等方面。,1.1,原理,DNA,变性剂中变性（解链）,DNA,序列决定解链行为,解链,DNA,在凝胶的不同位置停止迁移，使长度相同而序列不同的,DNA,片段分离,根据电泳条带的多寡和条带的位置、强度可以辨别出样品中微生物的种类和数量，分析土壤样品中微生物的多样性。,DGGE,不是基于核酸分子量的不同将,DNA,片段分开，,而是根据序列的不同,，将片段大小相同的,DNA,序列分开。,A,T,C,G,双链,DNA,分子中，由于这四种碱基的组成和排列差异，使不同序列的双链,DNA,分子具有不同的解链温度。,100,变性剂：,7M,的尿素和,40,的去离子甲酰胺的混合物,1.2,应用,微生物类群多样性,环境微生物变化的动态检测,有助于发现新的微生物,对功能基因多样性的研究,1.3,缺点,DGGE,最多能分离,1kb,的,DNA,片段，这些序列只能提供有限的系统发育信息；,如果选用实验条件不当，不能保证将有一定序列差异的,DNA,片段完全分开，出现序列重叠；,有些细菌具有多操纵子，,DGGE,能将其在,PCR,时形成的不同序列分离开，这样就可导致过高的估计环境中的微生物多样性,；,DGGE,通常只能检测到环境中的优势菌群的存在,。,氰戊菊酯处理土壤样品的,PCR,DGGE,图谱分析,2.,PCR-SSCP,（,PCR-restriction fragment length polymorphisms,）方法,PCR-SSCP,分析技术是一种,DNA,单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长,DNA,单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异,。,单链,DNA,片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的,当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变,空间构象有差异的单链,DNA,分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同,因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,(PAGE),，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开,方法原理,DNA,片段长度应使用的丙烯酰胺浓度,DNA,片段长度（核苷酸数）,丙烯酰胺（,%,）,1kb,700b,3.5,700b,500b,5,500b,200b,8,200b,12,DNA,链大小,DNA,链的自身结构,温度,电压,影响,DNA,迁移率的因素：,注意事项,核酸片段的大小,:,核酸片段越小，检测的敏感性越高。对于,200bp,的片段，可发现,70,变异；,300bp,能发现,50,的变异；,500bp,的片段，仅能检出,10,30,的变异,（,150bp,左右较好）,电泳温度,:,保持凝胶内温度恒定是,SSCP,分析最关键的因素。,凝胶的浓度,、,厚度,及,长度,:,一般使用,5,8,的凝胶,，,尽量使凝胶越薄越好,，,凝胶板长度在,40cm,以上。,假阴性,:,如没有污染，,PCR,SSCP,分析不存在假阳性结果，但可能出现假阴性结果，由于点突变引起的空间构象变化甚微，迁移率相差无几所致，尤其是点突变发生在扩增片段的两端时。应通过设置阳性对照，摸索电泳条件，假阴性结果在很大程度上是可以避免的,结果分析,:,一般形成两条单链带。,PCR,产物进行单链凝胶电泳之前，通过加热变性产生单链。如变性不彻底，残留双链亦可形成一条带因此，,PCR,SSCP,分析结果至少显示三条带。,3.,PCR-RFLP,（,PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism,）方法,当,DNA,或,RNA,分子由于单碱基突变或序列重 排，使某种酶切位点增加、减少或消失，导致限制性酶切片段长度发生改变，就产生 了限制性片段长度多态性，由于限制性内切酶在,DNA,分子上有特异的酶切位点，根据 其识别序列的位置和数量，可以把大小相似而序列有差异,DNA,切割成不同的片段通过 核酸电泳，可将长度不等的,DNA,片分离而显出其长度多态性,(,片段的大小,),。,4.,PCR-T-RFLP,（,PCR-Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism,）方法,TRFLP,是以荧光标记引物,PCR,为基础,根据末端限制性片段长度区分出微生物群体组成的一种微生物群体图谱法,.,原理,选取具有系统进化标记特征的,DNA,序列为目的序列,用荧光物质标记,1,个或,2,个引物的,5,端,PCR,产物用四碱基限制性内切酶进行消化，用测序仪识别标记末端，得到不同的末端片段峰，每一个峰可至少代表一种类型的微生物,根据峰的大小和数量，分析出微生物群体的组成和动态变化。,常用的荧光物质：,四氯荧光素,TET(5-tetrachloro-fluorescein),绿色的六氯荧光素,HEX(5-hexachloro-fluorescein),蓝色的六羧基荧光素,6-FAM6-carboxy-fluorescein),细菌,真菌,真菌,+,细菌,305bp,306bp,307bp,308bp,310bp,芽孢杆菌,注意事项,（,1,）,DNA,模板的完整性,（,2,）标记性,DNA,序列区段的特异性,（,3,）标记性,DNA,的扩增,（,4,）四碱基限制性内切酶的选择（,Hae,、,Hinf,、,Msp,）,选酶原则,（,1,）能够明显区分出不同的微生物，即产生的末端片段峰大小区别明显,尽量避免只差一个碱基的情况,（,2,）消化后产生的单峰具有特异性,产生的杂峰尽可能少,细菌,16S,与,23S rRNA,基因之间的大小核糖体基因间隔序列,ITS(Internal Transcribed Spacer),逐渐被关注。该区段具有变异性强、分化程度高等特点,其变异速率为,16S rRNA,基因的,10,倍。,