1、单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,细胞器的分级分离,高等植物叶绿体制备,动物细胞线粒体的分离,实 验 目 的,学习分离细胞器的一般原理及方法,实验原理,细胞内不同细胞器的比重和大小都不相同，在均匀密度介质中不同离心力下沉降的细胞器组成不同,或,在梯度介质中离心后分布于不同密度层,，根据这一原理，,差速离心法,或,密度梯度离心法,就可将细胞内各种组分分离出来。,分离流程：,破碎组织（匀浆或研磨）差速离心或密度梯度离心分离细胞器结果检验分析,匀浆（,Homogenization,）,低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质,(,
2、即,0.25mol,L,蔗糖一,0.003mol,L,氯化钙,),进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。,各种匀浆、研磨器,差速离心分级分离,(Fractionation),由低速到高速离心逐渐沉降细胞器。,先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速将上清液中的小颗粒沉淀下来。,Differential centrifugation,High speed,Low speed,密度梯度离心,（,density gradient centrifugation method,）,亦称,平衡密度梯度离心法,。,用超速离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从,液面到
3、底部出现一定的密度梯度,。,若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。,Velocity(A)and Equilibrium(B)sedimentation,分析,分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。,（一）实 验材料,多叶绿菜,实 验试剂,0.4M,蔗糖,0.35M,氯化钠（每升,19.856g,氯化钠）,实 验用品,1,、普通台式离心机：,4,台,2,、研钵：,30,个,3,、,40ml,小烧杯,:30,个,4,、纱布：,5,包,5,、离心管,60,支,
4、6,、载玻片及盖玻片见指导。,一、叶绿体的分离,细胞中及匀浆中的叶绿体,叶绿体的分离步骤,1,、采样、洗涤、去叶脉,：最好在晴天上午,10,时左右选取生长正常的菠菜叶子（菜心、白菜、豌豆也可）洗干净，用吸水纸擦干，去柄及粗脉,2,、预冷：,放入,4,冰箱预冷,1h,；,3,、,研磨匀浆,：称,2,克叶子在玻璃研钵中剪碎，先加,1,2m1,制备液，快速磨成匀浆，然后再加,8m1,制备液，磨匀；,4,、过滤：,把匀浆液倒在,6,层沙布上过滤入小烧杯；,5,、离心去完整细胞、细胞核等,：上述滤液转入,10ml,离心管，平衡后在约,500rpm,（每分钟的转速）离心,2,分钟，上清转入另一离心管；,6,、离心收集叶绿体：,上清液在,2600rpm,离心,5,分钟，弃上清液，沉淀即是叶绿体。,7,、悬浮叶绿体：,沉淀中加入制备液适量，用吸管吹打悬浮、混匀：,8,、镜检分离效果,9,、叶绿体被膜完整度的测定：铁氰化钾光还原的,Hill,反应,叶绿体的分离应该注意哪些问题？,1,、选材,2,、低温,3,、缓冲系统：渗透压、,PH,、,防氧化,4,、研磨程度,5,、离心速度,
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