SDS—聚丙烯酰胺垂直平板电泳.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,SDS,聚丙烯酰胺垂直平板电泳,一 实验原理,十二烷基硫酸钠（,SDS,）是一种阴离子去污剂。由于,SDS,分子本身带有负电荷，能够与蛋白质的疏水区相结合，使蛋白质伸展和解离，从而使蛋白质呈一致的强负电荷。当采用加,SDS,的聚丙烯酰胺进行电泳时，利用聚丙烯酰胺凝胶的分子筛效应，可以进行蛋白质分子量的测定。,在用该方法进行分子量的测定中，是利用某些已知分子量的指示蛋白质与经,SDS,处理后解离成单链的蛋白质样品进行电泳比较，根据蛋白质的电泳迁移率，在一定的分子量范围内与分子量的对数所呈的线形关系，就可以测出单链样品蛋白质的分子量。用该方法测得的是蛋白质亚基的分子量。,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳可以采用园盘电泳的形式，也可以采用垂直平板电泳的形式，其原理相同，操作步骤也大致相同。另外,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳亦分为不连续系统和连续系统。本实验采用垂直平板以不连续系统的,SDS,聚丙烯酰胺凝胶方式进行电泳。垂直平板电泳的优点在于在一块凝胶平板上可以同时进行不同样品的电泳。因此条件一致，更加便于比较。,二 实验目的与要求,（,1,）、学习与了解,SDS,聚丙烯酰胺垂直平板电泳的方法,（,2,）、通过对某一蛋白质样品的分子量测定，了解和掌握该方法的,分子量测定技术。,三 实验仪器与器材,3-1,、,实验仪器,：,（,1,）、垂直平板电泳槽装置（套）；,（,2,）、电动磁力搅拌器,（,3,）、电动脱色仪,（,4,）、电泳仪,（,5,）、电 炉,（,6,）、天 平,（,7,）、混合器,3-2,、,主要实验器材,（,1,）、可调取液器,（,2,）、微量注射器,（,3,）、医用注射器,（,4,）、,8#,针头,（,5,）、烧 杯,（,6,）、洗耳球,（,7,）、量 筒,（,8,）、培养皿,（,9,）、吸水纸,（,10,）、记号笔,四 实验试剂与配制,4-1,、实验试剂,（,1,）、丙 烯 酰 胺 （,Acr,）,（,2,）、甲叉双丙烯酰胺 （,Bis,）,（,3,）、过 硫 酸 铵 （,AP,）,4,）、四 甲基 乙二胺 （,TEMED,）,（,5,）、三羟甲基氨基甲烷 （,Tris,）,（,6,）、考马斯亮兰,G-25,（,7,）、十二烷基硫酸钠 （,SDS,）,（,8,）、,2,巯基乙醇,(EtSH),（,9,）、甘氨酸 （,gly,）,（,10,）、溴酚兰,（,11,）、甘 油,（,12,）、盐 酸,（,13,）、琼脂糖,（,14,）、甲 醇,（,15,）、冰醋酸,（,16,）、牛血清白蛋白 （,BSA,）；,MW,：,66,200,道尔顿,（,17,）、鸡蛋白蛋白 （,CEA,）；,MW,：,42,000,道尔顿,（,18,）、低分子量标准指示蛋白：分子量范围,10000,100,000,兔磷酸化酶,-B,；,Rabbit Phosphorylase b,；,MW,：,97,400,道尔顿,牛血清白蛋白；,Bovine Serum Albumin,；,MW,：,66,200,道尔顿,兔肌动蛋白；,Rabbit Actin,；,MW,：,43,000,道尔顿,牛碳酸酐酶,Bovine Carbonic Anhydrase,；,MW,：,31,000,道尔顿,胰蛋白酶抑制剂；,Trypsin Inhibitor,；,MW,：,20,100,道尔顿,鸡蛋清溶菌酶；,Hen Egg White Lysozyme,MW,：,14,400,道尔顿,4-2,、试剂配制,（,1电极缓冲液的配制：,（,2,）、丙烯酰胺,(Arc),和甲叉双丙烯酰胺,(Bis),溶液的配制：,（,3,）、,10%,十二烷基硫酸钠,(SDS),溶液的配制：,（,4,）、,10%,过硫酸铵,(AP),溶液的配制：,（,5,）、,pH8.8,；,1.5 mol/L,三羟甲基氨基甲烷,HC1 Buffer,的配制,（,6,）、,pH6.8,；,1.0 mol/L Tris,HC1 Buffer,的配制：,（,7,）、四甲基乙二胺,(TEMED),，直接取原液。,（,8,）、,2%,琼脂糖溶液的配制：（用于封电泳槽渗漏）,（,9,）、,0.05%,溴酚兰溶液的配制：（,10,）、样品溶液的配制：,0.5 mg/1.0ml,（,11,）、标准品溶液的配制,:,（,12,）、染色液的配制：,（,1,3,）、样品溶解,Buffer,溶液的配制,1M Tris,HC1 pH6.8 0.5 ml,甘油,0.8 ml,10%SDS 1.6 ml,2,巯基乙醇（,EtSH,）,0.4 ml,0.05%,溴酚兰,0.2 ml,蒸馏水（,DDW,）,4.5 ml,8.0 ml,需要同学自己配制的试剂溶液,（,14,）、脱色液的配制：，,400-500,毫升,/,组,冰醋酸：甲醇：水,=7.5,：,5.0,：,87.5(V/V),五 方法与步骤,五 方法与步骤,(,一,),、凝胶的聚合,1,、垂直平板电泳槽的装配,2,、分离胶及浓缩胶的配制,3,、分离胶的制备,4,、堆集胶的制备,(,二,),、加标准品和样品溶液,1,、加样量,2,、加样方法,(,三,),、电泳,(,四,),、处理凝胶区带,1,、染色,2,、脱色,(,五,),、鉴定,5-,1,、,凝胶的聚合,5-1-1,、,垂直平板电泳槽的装配,（,1,）、在洁净的电泳槽和玻璃平板两边缘中间各添加一块小垫条，紧紧,贴合四只夹子（一边二只），以致密封。,（,2,）、用滴管吸取经沸水加热溶解的,2%,琼脂糖溶液，趁热灌注于玻璃平,板的底槽，待琼脂糖凝固后，底层即封闭（需避免气泡）。,（,3,）、再在玻璃平板槽内用注射器（或滴管）加蒸馏水至满刻度，并观,察是否有渗漏现象如有渗漏，则需要重新安装玻璃平板槽，应确,保无渗漏，然后弃去槽内蒸馏水,并用吸水纸轻轻吸去槽内未弃尽,的蒸馏水。,5-1-2,、,分离胶及浓缩胶的配制：见下表。,表,1,：分离胶及浓缩胶的配制,名 称,体 积,ml,名 称,体 积,ml,12%,分离胶,8.00,5%,浓缩胶,4.00,DDW,2.60,DDW,2.75,30%Arc+Bis,3.20,30%Arc+Bis,0.65,1.5M Tris,（,pH8.8,）,2.00,1.0M Tris,（,pH6.8,）,0.50,10%SDS,0.08,10%SDS,0.04,10%AP,0.20,10%AP,0.10,TEMED,7.0 ul,TEMED,8.0 ul,5-1-3,、分离胶的制备,(1),、取一小烧杯,按表,1,比例配制分离胶,.,（,2,）、用带有长针头的注射器吸取分离胶混合贮液，慢,慢注入垂直放好的平板槽内，直至胶液高度为,7cm,。（取胶的注射器要及时用自来水冲洗干净，,否则针头易堵塞）,（,3,）、然后再在胶面仔细加注厚约,0.5-1.0,厘米的蒸馏,水层，在室温下静置,40,分钟左右进行聚合，这时,可根据界面现象进行辨别，当有明显的分层现象,出现时，即表明凝胶已聚合完毕。,（,4,）、聚合后将蒸馏水轻轻倒掉，并用吸水纸轻轻吸去,垂直玻璃平板槽残留的蒸馏水。,5-1-4,、浓缩,(,堆集,),胶的制备,（,1,）、取一小烧杯,按表,1,比例配制浓缩胶,（,2,）、将混合好的堆集胶贮液用带有长针头的注射器吸取加注到分,离胶胶面上，直至高度约为,2cm,。,（,3,）、再将梳板的梳齿插入到平板顶部的槽内，并保证梳齿的,2/3,部分浸没在堆集胶液内（如高度不够，可适量添加贮液）。,在室温下，静置,40-60,分钟。,（,4,）、堆集胶聚合后（如果堆集胶面不用梳板，则可加水层以使界,面平整），将梳板轻轻垂直地从顶槽内取出，这时即可出现,一个个齿孔（凹槽）。用小滤纸条吸去齿孔内残液，但不能,触及和移动齿。,5-2,、,加标准品和样品溶液,5-2-1,、加样量,：,用微量注射器吸取,（,1,）、溴酚兰溶液,10ul (0.05%,溴酚兰,),（,2,）、标准品溶液,10ul (200 ul/,小小瓶,),（,3,）、样品溶液,5ul,（,0.5 mg/ml,）,5-2-2,、加样方法,（,1,）、先加样，后加电极溶液,：,分别小心将样液加注到平板槽内的各自标记齿孔内（各孔内的样品不能相混），加样完毕后,将准备好的电极溶液分别轻轻倒入上、下电极槽内，特别是在加注上电极溶液时，一定要沿槽内壁轻轻加入，以防冲动各齿孔内的样品液所引起相互混合和扩散。,（,2,）、先加电极溶液，后加样,：,也可先将上、下电极槽内加注电极溶液后，再在上槽各自标记齿孔内加样，这样可以完全避免在加电极液时所引起样品溶液相互混合和扩散。,5-3,、电泳,加完样品和电极液后，接上上、下电极的电源（电极一定要浸入电极,溶液内）,。,上电极,接电泳仪,负极,，,下电极,接电泳仪,正,极,，,开启电泳仪，使,稳压,：,120,伏特,。待溴酚兰指示前,沿到达下端时（,3,小时左右），关闭电泳仪，停止电泳,5-4,、处理凝胶区带,5-4-1,、染色,将垂直平板电泳槽上的玻璃平板轻轻扳开，用不锈钢小铲刀，,将凝胶板从电泳槽上面铲下来，,放入一合适的干净培养皿内，然后加入适量染色液，于摇床上,进行振摇固定染色,30,分钟，完毕，在培养皿中用清水洗,2-3,遍。,5-4-2,、脱色,在培养皿内加入适量脱色液于摇床上进行振摇（,2,小时,/,次，,需,3,次）脱色多次直至色带完全清晰为止,。,5-5,、鉴定,最后根据染色所出现的区带，测量和记录标准品和样品中,各蛋白质的迁移率，绘制出类似凝胶板的图形,标准品中,的各自蛋白质的迁移距离（,cm,）为址标和相对应的对数,（,Log MW,）纵坐标，绘制低倆子量蛋白质标僆曲线并,今标准曲线图上查品蛋剽质的分子量，亦可采琨半对敐,坐标纸的作图方式，还可以用,Excel,方法瑴接计算打占冺相,关图和计笇结果。,作业建议,表,1,：标准品各蛋白质分子量及相应对数分子量和迁移率表,名 称,分子量（,MW,）,（道尔顿）,对数分子量,（,Log MW,）,迁移率,（,CM,）,兔 磷 酸 化 酶,B,97,400,4.99,牛 血 清 白 蛋 白,66,200,4.82,兔 肌 动 蛋 白,43,000,4.63,牛 碳 酸 酐 酶,31,000,4.49,胰 蛋 白酶 抑制剂,20,100,4.30,鸡 蛋 清 溶 菌 酶,14,400,4.16,表,1,：标准品各蛋白质分子量及相应对数分子量和迁移率表,Fermentas,公司,名 称,分子量（,MW,）,（道尔顿）,对数分子量,（,Log MW,）,迁移率,（,CM,）,B-,半乳糖苷酶,117,000,牛 血 清 白 蛋 白,85,000,卵 清 蛋 白,48,000,碳 酸 酐 酶,34,000,乳球 蛋 白,26,000,鸡 蛋 清 溶 菌 酶,14,900,图,2,：蛋白质分子量标准曲线,特别提醒,一定要给出文字性的结果,