不同畜禽血样采集、哺乳动物白细胞分离.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,华中农业大学动物科技学院,实验一 哺乳动物白细胞分离,左 波、柴 进,了解哺乳动物白细胞分离原理,掌握兔及猪白细胞分离方法,明确畜禽血液细胞组成差异,一、实验目的,二、实验原理,真核基因组,DNA,存在于细胞核的染色质中,血液,新鲜组织,福尔马林浸泡标本,石蜡标本,冰冻组织,毛发,体腔液,洗嗽液,精液,1,常用于,DNA,提取的材料：,血液,血 浆（,50-60%,）,晶体物质,2-3%,水份,90-92%,血浆蛋白,5-8%,血细胞（,40-50%,）,红细胞,白细胞,血小板,2,血液组成,红细胞,又称红血球或红血细胞，是血液中最多的一种血细胞。红细胞中含有血红蛋白，因而使血液呈红色。,人和哺乳动物的成熟红细胞无细胞核,白细胞,白细胞无色呈球形，,有细胞核,，体积比红细胞大,光镜下，根据白细胞胞质有无特殊颗粒，可将其分为有粒白细胞和无粒白细胞。有粒白细胞又根据颗粒的嗜色性，分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。无粒白细胞有单核细胞和淋巴细胞两种,白细胞,有粒,嗜酸性粒细胞,中性粒细胞,嗜碱性粒细胞,无粒,单核细胞,淋巴细胞,血小板,也称血栓细胞，是体内最小的血细胞，是由骨髓中成熟的巨核细胞裂解、胞质脱落而成，呈圆形、椭圆或不规则的形状，,无细胞核,。,但它并非只是细胞碎片，它有一定的结构，能进行新陈代谢。,血小板的功能主要是促进止血和加速凝血,血小板遇到粗糙的血管壁伤口，就被破坏并释放出促使血液凝固的凝血酶。这种酶的前身是凝血酶原，在,Ca,2+,参与下，凝血酶原激活物可催化凝血酶原转化为具有活性的凝血酶。,在凝血酶、,Ca,2+,和其它一些因子的作用下，经过一系列变化，,可溶性的纤维蛋白原就变成了不溶性的丝状纤维蛋白,。这种蛋白形成后，互相交织成网，并把血细胞网罗在内，使原来的血液凝集成块。,3,抗凝,可通过以下几种途径来实现：,（,1,）往血液中加入适量的抗凝剂（如柠檬酸钠）将,Ca,2+,夺去，使其成为,失钙血,，这样可以防止纤维蛋白原变成纤维蛋白，从而避免了血液凝固。,（,2,）用试管刷反复搅拌，取出血液中的纤维蛋白，这种血叫,去纤维蛋白血,。由于缺少了凝血必需物质（纤维蛋白），所以血液不再凝固。,（,3,）降低血液温度，使酶的活性降低,。,（,4,）保护血小板，减少凝血酶的释放。,抗凝剂,（,1,）乙二胺四乙酸（,EDTA,）盐，,EDTA,有二钠、二钾和三钾盐。均可与钙离子形成螯合物，从而阻止血液凝固。,Na,2,C,10,H,14,O,8,N,2,+Ca,2+,CaC,10,H,12,O,8,N,2,+2Na,+,+2H,+,适用于全血细胞分析及血细胞比容测定。,（,2,）柠檬酸钠（,trisodium citrate,），柠檬酸盐可与血中钙离子形成可溶性螯合物，从而阻止血液凝固,2Na,3,C,6,H,5,O,7,+2Ca,2+,2CaC,6,H,5,O,7,+6Na,+,适用于红细胞沉降率和凝血功能测定。,（,3,）草酸钠（,sodium oxalate,），草酸盐可与血中钙离子生成草酸钙沉淀，从而阻止血液凝固。适用于一般普通生化检查,（,4,）肝素（,heparin,），肝素的阴离子活性基团与抗凝血酶III,（,AT-III,）的阳离子基团结合，,加速抗凝血酶,-,凝血酶复合体形成,，灭活丝氨酸蛋白酶，从而阻止凝血酶形成，拮抗凝血酶和阻止血小板聚集。此外肝素还有,催化抑制凝血因子,的作用。适用于血流变检查,从血管取少量血液加入适量抗凝剂,有形成分经自然沉降或离心沉淀后，血液可分出三层：上层为淡黄色的血浆，下层为红细胞，中间的薄层为白细胞和血小板,4,白细胞分离,5,细胞破碎,方法,技术,原理,效果,成本,举例,化,学,法,渗透冲击,渗透压破坏细胞,温和,便宜,溶血,酶消化法,细胞壁被消化，使细胞破碎,温和,昂贵,增溶法,表面活性剂溶解细胞壁,温和,适中,胆盐作用于大肠杆菌,脂溶法,有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳,适中,便宜,甲苯破碎酵母细胞,碱处理法,碱的皂化作用使细胞壁融解,剧烈,便宜,方法,技术,原理,效果,成本,举例,机,械,法,匀浆法（片型）,细胞被搅拌器劈碎,适中,适中,动物组织及动物细胞,研磨法,细胞被研磨物磨碎,适中,便宜,超声波法,用超声波的空穴作用使细胞破碎,适中,昂贵,细胞悬浮液小规模处理,匀浆法（孔型）,须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪切力而破碎,剧烈,适中,细胞悬浮液大规模处理,珠磨破碎法,细胞被玻璃珠或铁珠捣碎,剧烈,便宜,细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理,渗透冲击法（,Osmotic Shock,）,此法将一定体积的细胞液加到,2,倍体积的水中，细胞中溶质浓度高，水不断进入细胞，使细胞膨胀，最后导致破裂。,在血浆中无机盐形成的渗透压称为晶体渗透压,由血浆蛋白形成的渗透压称为胶体渗透压,血浆渗透压的总值为两者之和。,红细胞在此溶液中大小、形状不变，故称为生理盐水,原理,0.9%,氯化钠溶液的渗透压与血浆渗透压相等,血液中去除血细胞后余下部分就是血浆。,将正常红细胞悬浮于不同浓度的,NaCl,溶液中即可看到：在等渗溶液中的红细胞保持正常大小和双凹圆碟形；在渗透压递减的一系列溶液中，红细胞逐步胀大并双侧凸起，当体积增加,30%,时成为球形；体积增加,45%,60%,则细胞膜损伤而发生溶血。,红细胞在低渗溶液中会胀大，破裂，发生溶血，故低渗溶液不能用作静脉输液。,高于或低于血浆渗透压的则相应地称为高渗或低渗溶液。,细胞破碎的难易决定于其类型，红血球细胞容易溶破，动物组织细胞只有当其组织被机械切碎或匀浆后才易溶破。植物细胞很难溶破，因为植物细胞中含有大量的木质成分。,三、主要仪器及试材,实验器材：,一次性注射器，长针头，,10ml,离心管，记号笔，酒精棉球，离心机，一次性手套等,试 剂,：,蒸馏水，抗凝剂（,0.5M EDTA,溶液、或肝素）等。,四、实验方法与步骤,采血,5ml,左右，,EDTA,抗凝,3000rpm,离心,15min,，弃上层血浆,加入,2,倍体积双蒸水，摇匀沉淀，静置,10-15min,，破碎红细胞,3000rpm离心,15min,，轻轻弃去上层，留白细胞沉淀（视红细胞破碎程度，决定是否重复此步骤,1,次）,五、实验注意事项,（,2,）采血后，应立即（或提前）加入,1/10,血样体积的,0.5M EDTA,抗凝剂，充分混匀，低温保存或立即送实验室分离白细胞；,（,1,）防止污染血液及被血液所带的病菌等感染,（,3,）分离白细胞时，离心速度不宜过大。,六、实验结果处理,提交“哺乳动物白细胞分离”实验报告（统一格式纸张）,实验目的,实验原理,实验器材,实验方法与步骤,实验结果与分析,思考题,七、思考题,（,1,）畜禽血液有核细胞构成的差别；,（,2,）,EDTA,抗凝机制；,（,3,）渗透冲击法破碎细胞原理。,