第3章 质谱技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章 质谱技术,Mass spectrumMS,内容：,第一节 质谱学基础,第二节 高效液相色谱质谱联用,第三节 生物质谱简介,第一节 质谱学基础,什么是质谱,质谱仪的基本结构,质谱仪的主要性能指标,质谱图及其判读,第二节 高效液相色谱质谱,(HPLC-API MS),HPLC-ESIMS,(,电喷雾电离,),HPLC-APCI,(,大气压化学电离,),HPLC-APPI,(,大气压光致电离,),HPLC,APIMS,方法开发,LC,MS,联用所面临的两大问题,液相色谱流动相的量比质谱所能忍受的量大得多。典型流量是,1mL/min,气化后相当于气体流速,150,1200mL/min,，而现代质谱只能忍受的气体流量只有,1,20mL/min,；,液相色谱的研究对象是难挥发和热不稳定的化合物，这些化合物用常规电离方法是很难电离的。,关于,LC,MS,的研究主要致力于解决上述两个问题。,LC/MS,电离技术的相对适用性,HPLC-ESIMS,(,电喷雾电离,),检测器,喷雾室,离子阱,加热的氮气干燥气,双电子毛细管入口,雾化气,(,气体用红色显示,),),溶剂喷雾,+,+,电喷雾,离子,-4000 V,电喷雾电离源,API-Electrospray Ion Source,高电压装置,电喷雾电离离子形成的必要步骤,步骤,1,溶液中的电离,样品的,pK,a,溶液的,pH,步骤,2,喷雾,表面张力和粘度,气动辅助,步骤,3,去溶剂,干燥气温度和流速,热容量，,H,vap,步骤,4,离子从溶液中解吸,溶解能,步骤,5,气相中的离子反应,质子亲合力,电荷交换,步骤,1,在溶液中如何产生离子？,离子种类,NH,4,+,PO,4,-,酸,/,碱化学性质,M-NH,2,+,酸,M-NH,3,+,+,酸,-,（正离子检测）,M-COOH +,碱,MCOO,-,+,碱,+,（负离子检测）,缔合,（,对类似糖的中性物质）,M,+Na,+,M-Na,+,（,碱金属，如,20,m,M,乙酸钠）,衍生化,形成离子或酸,/,碱产物,步骤,2,气动辅助电喷雾产生带电液滴,含有约,100,000,电荷、直径,2,m,的带电溶剂液滴,由于溶剂组成或流速，气动喷雾减小了液滴的大小对粘度和表面张力的偏离,喷雾柱体、端板和毛细管上的场使液滴带电,步骤,3,带电液滴的去溶剂,热干燥气体,加热的氮气蒸发了液滴，增加了电荷,/,体积比。,Rayleigh,极限,是带电液滴能够存在的最大 电荷,/,体积比。当电荷超过这个极限时，发生,库仑破裂,。,液滴的,Cont,库仑分裂,Rayeigh,破裂释放出较小的最终变成样品离子的液滴。,50-100 nm,带电液滴包含,100,个电荷,这些液滴包含母体液滴中,10-20%,的电荷但仅仅,2%,的质量。,步骤,4,从溶液中解吸离子,当液滴的场强超过分析物在溶液中的溶解能时，离子解吸进入气相。,带电残余物,离子蒸发,蒸发,Rayleigh,极限,Coulomb,爆裂,蒸发,被分析离子,步骤,5,气相中的离子反应,通过离子传输区域时从大气压喷雾室的反应中会发生质子转移和电荷交换反应。这个高压区允许发生,1000,次离子,/,分子反应。,质子转移,:,气相质子转移反应使分子带电,M+NH,4,+,M+H,+,+NH,3,帽电压,裂解区,雾化气压力,干燥气,温度和流速,雾化气压力,800,L/min 50-70 psig,干燥气流速,(6-12,L/Min),含水高需更高的流速如果太底，液滴会导致谱图中的尖峰,当有疑问时，使用过量的,干燥气温度,蒸汽压越低的溶剂温度越高,开始为,300-350,C,帽电压,用,FIA,优化,(2000-5000),开始,3000 V,在负离子模式，注意高的室电流或兰色光辉（电晕针显示）：当这现象发生时须降低帽电压,电喷雾喷雾室设置,样品,在溶液中为离子态,:,儿茶酚胺、硫酸酯共轭物、丁基胺,有可诱导电离的化合物：甲醇,含杂原子的化合物：氨基甲酸酯类，苯并二氮杂草类,溶液中带多电荷：蛋白质、多肽、低聚核甘酸,溶液化学参数,流速,样品的,pK,溶液,pH,溶液导电性,应避免的样品,尤其非极性的样品：,PAHs,PCBs,电喷雾需考虑的问题,溶剂,+,H,+,+A,溶剂,+A+H,+,雾化,蒸发液滴,气相电离,HPLC-APCI,(,大气压化学电离,),APCI,离子化机理,Vcap,Corona,current,Nebulizer,Pressure,Fragmentor,Drying gas,Temperature,and Flow,Heater,APCI,离子化机理,气化,溶剂电离,电荷交换给分析物,N,2,(,从干燥气,)+,e,-,N,2,+,+2e,-,N,2,+,+,2N,2,N,4,+,+N,2,N,4,+,+,H,2,O,H,2,O,+,+2N,2,H,2,O,+,+H,2,O,H,3,O,+,+OH,H,3O,+,+M,M+H,+,+H,2,O,APCI,离子源,电晕针,HPLC,流速,500,L/min,雾化气压力,60,psig,干燥气温度,start with 350,C,干燥气流速,4,L/min,气化温度,随,FIA,调节,帽电压,随,FIA,调节,(2000-6000),开始,2500 V,电晕电流,随,FIA,调节,开始,25 A(,neg,),或,4 A(pos),帽电压,电晕针,电流,雾化气,压力,碎裂区,干燥气,温度和流速,加热器,APCI,喷雾室的设置,样品,分子量和极性中等的化合物：,PAHs,PCBs,脂肪酸,邻苯二甲酸酯类；,不含酸性和碱性位点的化合物（碳氢化合物、醇、醛、酮和酯）；,含有杂原子的化合物：脲、苯并二氮杂草、氨基甲酸酯；,具有,一定挥发性的化合物,排除了分子量较大和极性较大的分子,如蛋白质,/,多肽；,电喷雾响应不好的样品；,溶液化学参数,较,ES,对溶液化学作用不灵敏,较,ES,更耐大的流速,适用,ES,不宜的一些溶剂,应避免的样品,在气化过程中热不稳定的化合物,APCI,需考虑,电喷雾电离,:,其电离过程通过电场产生带电液滴，接着样品离子通过离子蒸发后，进行质谱分析。适用于,在溶液中为离子态或可诱导电离的化合物。,适用于,分子量较大和极性较大的分子,如蛋白质,/,多肽；,大气压化学电离,(APCI):,气相化学电离,(,CI),过程中溶剂相当于,CI,反应气来使样品电离。适用于,分子量和极性中等的化合物,和,具有一定挥发性的化合物,排除了分子量较大和极性较大的分子。,小 结,HPLC,APIMS,方法开发,HPLCMS用途,成份确认或定性及半定量，如合成产物分析，,FIA,无光谱吸收物质的定量,低含量和色谱未分离成份的测定，如杂质检查，,SIM,，,LC,条件优化,未知样品的分析，如中药分析，与,DAD,结合,Multi-channel data acquisition,大分子,样品分析，,pH,至关重要,样品前处理,质谱检测条件,检测离子模式，离子化参数设定,液相色谱条件,ESI,液质分析,APCI,液质分析,样品导入方式Infusion,HPLC,FIA,柱后修饰技术,样品前处理,了解样品情况,种类,纯度或含量,，,溶解度，存储条件，挥发性，热稳定性,分子结构，,pK,值，,pI,值,影响,LC/MS,分析的主要因素,盐,背景或基质成份,(,离子化,),浓度,ng,/ml,dimer,真空度，溶剂雾化,质谱条件,-,离子源选择（,1,）,ESI,待测物无需有挥发性,热不稳定成份首选,离子在溶液中已形成,形成单电荷离子和多电荷离子,流速,500,L/min,质谱条件,-,离子源选择（,2,）,ESI,在溶液中已是离子态,cat,a,cholamines,sulfate conjugates,quaternary amines,含杂原子化和物,carbamates,benzodiazepines,带多电荷成份,proteins,peptides,oligonucleotides,对,APCI,响应弱的物质,APCI,中等分子量和中等极性成份,PAHs,PCBs,fatty acids,phthalates,alcohols,aldehydes,ketones，etc,.,含杂原子化和物,carbamates,benzodiazepines,对,ESI,响应弱的物质,质谱条件,-,离子模式选择,正离子,ES,模式：,适合于碱性样品,，,amines,amides,aminoacids,antibiotics,，,etc,有杂原子,(N,2,O,2,),可接受,H,+,、,Na,+,、,NH,4,+,，如,NH,2,、N、NH、CO、COOR,pH N,2,),可失去质子,?,COOH、SH、NO,2,pH pK+2,可正可负,:,比较灵敏度,质谱条件,-API,参数设定,ESI For aqueous levels above 50%,HPLC Flow rate(,l/ml),Nebulizer,Pressure(,psi,),Drying Gas Flow(l/min),Drying Gas Temp(,0,C),1-10,10-15,4,325,10-50,15-20,5,325,50-200,20-40,8,350,200-500,30-50,8-10,350,500-1000,50-70,10-12,350,HPLC Flow Rate(,l/min),Nebulizer,Pressure(,psi,),Drying Gas Flow(l/min),Drying Gas Temp(,0,C),APCI Temp(,0,C)*,200-1500,60,4,350,300-500,APCI Good sensitivity at above 500,l/min,，*,-,需优化,液相方法转为液质联用需要考虑：,-,色谱分离和待测物离子化,待测物的离子化能力,流动相及流速与质谱的匹配性,色谱柱与质谱的匹配性,色谱柱,流动相,流速,液相条件,-,选择相应的色谱柱,Application,Column I.D.,Flow Rate,Standard,2-4mm,500-2500,L/min,Narrowbore,1-2mm,100-500,L/min,Micro LC,1mm,800,m,40,L/min,20,L/min,Capillary LC,300,m,180 m,4L/min,2 L/min,Nano,LC,100,m,75 m,50 m,300nL/min,180nL/min,80nL/min,液相条件,-,色谱柱内径选择,ESI,Flow rate:11000l/min,1.0,2.1,3.0mm id,建议用,2.1mm,浓度相关,反相流动相,APCI,Flow rate:50-1500l/min,4.6,3.0,2.1mm id,建议用,4.6mm,浓度不相关，进样多，信号强,反相和正相流动相,液相条件,-,色谱柱颗粒度选择,5m Particles,扫描模式,wider peak width,简单样品,3.5m or 3000,对目标预期分子量选择加合离子和参数,选择反卷积参数蛋白质分子量,3000,选择反卷积参数概要,点击,反卷积,质谱图（,Deconvolute,-Mass Spectra,）,在谱图中找到多电荷成分,反卷积,Results,点击,反卷积,查看（,Deconvolute,-view,）,得到结果的详细列表,反卷积查看结果,Detailed list,在,反卷积,电荷状态标尺（,deconvolution,-charge state ruler,）,下选择可以手动,反卷积,所选择的质谱图,选择加合离子子和所需电荷状态,反卷积手动步骤,1,移动至电荷状态（,15,），点击鼠标左键,反卷积手动步骤,2,分子量,以,m/z,值、电荷状态和加合离子计算分子量,平均质量,平均,反卷积,中找到的所有信号的化合物质量值进行,Pred,峰（平均）,除以平均质量和电荷值，加上加合质 量计算,化合物质量,计算（实际峰加合离子）,x,电荷,电荷,质谱图中实际峰的电荷状态,理解反卷积的详细结果,