高效液相色谱法(HPLC)概述.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,高效液相色谱法,(,HPLC),High Performance Liquid Chromatography,第一节 概述,一、高效液相色谱法及其特点,1.,高效液相色谱法（,HPLC）,：以,经典液相色谱法,为基础，引入,气相色谱,的理论和实验技术，发展而成的,分离分析,方法。,2.高效液相色谱法与,经典液相色谱法、气相色谱法,的区别,（1）与经典液相色谱法的比较,经典柱色谱法分离过程,装载,样品,装载,溶剂,重力,洗脱,玻璃柱,硅胶,氧化铝,纤维素,滤网,10,50,100,150,Volume(mL),Time(hr),1.0,2.0,3.0,4.0,普通规格固定相,常压输送流动相,色谱柱一次使用,离线检测,高效液相色谱法分离过程,进样口,检测器,色谱图,色谱柱,溶剂,高压泵,混合器,高压输送流动相,高效固定相,在线检测,色谱柱多次使用,高灵敏检测器,差别：,主要在于,固定相的性质、形状及粒度,，其,次是,检测手段和输液设备,。,经典液相色谱,固定相：,粒 度：60600,m（,多孔）,柱 长：10200,cm（d=1050mm）,n,约为250/,m,流动相：,靠重力输送,经典液相色谱无,在线,检测器,缺点：,（1）粒度范围宽、不规则，不易填充均匀，,扩散和传质阻力大。,（2）无检测设备，分析速度慢、效率低。,只能做为,分离手段,高效液相色谱法,固定相：520,m，,球形。流动相：高压泵输液。,检测器：在线检测。,（2）高效液相色谱与气相色谱的比较,气相色谱法分离过程,1.载气瓶 2.压力调节器 3.净化器 4.稳压阀 5.柱前压力表 6.流量计 7.进样器 8.色谱柱 9.柱温箱 10.馏分收集口 11.检测器,12.检测器恒温箱 13.记录装置 14.尾气出口,HPLC,与,GC,的差别：,主要在于做为,流动相的液体和气体性质之间,的差别，其次是,操作条件和分析对象,的差别。,流动相,G C:,惰性气体，与组分分子间无作用力。只起运载,组分的作用。,HPLC:,各种液体与组分分子间有作用力，同时与固,定相展开对组分的竞争，对分离起很大作用。,分析对象,G C:,柱温下具有足够挥发性和热稳定性的物质、气,体或沸点较低的化合物。,操作条件,温度：,G C:,一定柱温下进行分离。,HPLC:,通常室温下进行分离。,检测器：,G C:TCD、FID、ECD、FPD,和,NPD,HPLC:UV、DAD、FD、RID,3.,高效液相色谱法的特点,（1）分离效能高（2）选择性高（3）灵敏度高,（4）分析速度快（5）应用范围广,二、高效液相色谱法在药物分析中的应用,色谱法具有分离分析两种功能，因此在药物分析,中，,HPLC,已成为对各类药物及其制剂进行鉴别、检查、,杂质分离及含量测定的主要手段。,中国药典,：19532005年共出版发行七版,滴定分析：各版均占50以上。,UV:,用于含量测定、含量均匀度或溶出度测定。,IR：,用于原料药鉴别（2000版444个品种）,85版开始收载,HPLC,法7项,90版76项；2000版200多项；2005版1000多项,美国药典委员会（,USPC）,成立于1820年，至今,近200年。出版发行了25版药典。,75年（19版）将,HPLC,载入药典,20版62项；21版363项；22版871项；,23版1188项；,24版含量测定方法：1386项,鉴别：519项,杂质检查：206项,如今：在评价世界各国药典水平时，,HPLC,法已,成为反映各国药典先进性的重要指标之一。,三、高效液相色谱法的分类,1.,按固定相的聚集状态分,液固色谱；液液色谱,2.,按溶质在两相间分离过程中的物理化学原理分,（,1,）吸附色谱（,Adsorption Chromatography,）,（,2,）分配色谱（,Partition Chromatography,）,（,3,）离子色谱（,Ion Chromatography,）,（,4,）空间排阻色谱（,Size Exclusion Chromatography,),（,5,）亲和色谱（,Affinity Chromatography,）,（,6,）手性色谱（,Chiral Stationary Chromatography,）,3.,按流动相压强分,（,1,）高效液相色谱法（,HPLC,）,（,2,）超高效液相色谱法（,UPLC,）,四、高效液相色谱法的应用范围和局限性,1.,应用范围,高效液相色谱法适于分析高沸点、受热不稳定易,分解、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性,物质和多种天然产物；合成和天然高分子化合物。,涉及石油化工产品、食品、药品、生物化工厂品,及环境污染物。约占全部有机物的,80,。,2.,方法的局限性,（,1,）使用多种溶剂为流动相，成本高，污染环境。,（,2,）缺少通用检测器,（,3,）不能完全替代气相色谱,（,4,）不适于分析受压分解、变性的具有生物活性,的生化样品分析,综上，高效液相色谱法与其他分析方法一样，,不是尽善尽美的。作为从事药物分析工作的人们在,掌握高效液相色谱法的特点、应用范围和局限性的,前提下，充分利用高效液相色谱法的特点，就可在,解决实际分析任务中发挥重要作用,。,第二节 高效液相色谱法的基本理论,一、高效液相色谱参数,1.定性参数,t,R、,t,0、,2.柱效参数,、,w,1/2,、w,w,=4,或,W=1.699w,1/2,3.相平衡参数,K,=,C,S,/C,m,k=m,s,/m,m,=C,S,V,S,/C,m,V,m,=K,.,V,S,/V,m,4.,分离参数,R,=1.0,裸露面积95.4,R,=1.5,裸露面积99.7,R,1.5,完全分开,二、高效液相色谱法的基本理论,色谱分析法的目的是将样品中各组分彼此分离，达到,可以测定的目的，然后用合适的方法进行定性、定量分析。,对于最难分离的物质对，分离有三种情况：,由三种分离情况可得出：,1.,两组分若想分开，,t,R,差别应足够大。即两组分迁移速度 不同,取决色谱体系热力学过程。,2.,两组分若想分开，色谱峰应足够窄。,峰宽窄,的本质,是组分在色谱柱内的扩散及在两相中达到分配平衡的速度,取决色谱体系动力学过程,（一）塔板理论,1.前提：四个基本假设,2.解决的问题：,（1）较好的描述色谱流出曲线的形状,（2）阐明了溶质的分布随流经色谱柱的流动相体积的变化,规律及溶质浓度极大点的位置,（3）定量说明色谱柱效以及决定色谱区域宽度参数，导出,了保留体积的基本关系式。,3.塔板理论是一种具有一定局限性的半经验理论，其缺点：,（1）,不能解释,u,不同（同一溶质），,H（n）,不同,（2）不能说明色谱柱结构参数、操作条件与塔板数的关系,（3）忽略了组分在色谱柱内的扩散和传质，因此不能解释,影响塔板高度的各种因素,综上：塔板理论对色谱体系的设计和色谱条件的选择的指导意义有限。,（二）速率理论,Van Deemter,方程,速率理论主要阐述使色谱峰展宽，柱效降低的各种动力学因素,GC,速率方程,Van Deemteer,方程式,HPLC,速率方程Giddings,方程式,涡流扩散项,纵向扩散项,传质阻抗项,涡流扩散项,纵向扩散项,流动相传质阻抗项,静态流动相传质阻抗项,固定相传质阻抗项,1.涡流扩散相（,H,E,）,H,E,=A=2,d,p,:,填充不规则因子（12）,d,p,：,固定相平均粒径,初始带宽,最终带宽,A,u,H,由上得出：,涡流扩散相只与固定相填充情况有关，涡流扩散相只与固定,相填充情况有关，与组分、固定相和流动相性质，流动相流速无,关。,2.纵向扩散相（,H,L,）,H,L,=B/u=2,D,m,/u,:,柱中填料间的填充因子；,D,m,:,溶质在流动相中的扩散系数。,B,线速度,u,H,u,高效液相色谱中，多数情况,H,L,=0，,这是存在无,限直径效应 的根本原因。,3.传质阻抗项（,H,R,）,H,R,=,H,s,+,H,m,+,H,sm,静态流动相,流动相,固定相,C.U,H,u,（1）固定相中的传质阻抗（,H,s,）,溶质分子从液体流动相转移进入固定相和从固定相移出重新进入流动相过程为传质。,