实时荧光定量PCR介绍.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,In-Fusion,克隆技术介绍,*,7/14/2011,27 December 2025,实时荧光定量,PCR,介绍,宝生物工程（大连）有限公司,主 要 内 容,Real Time PCR,基础知识,1,2,Real Time PCR,实验方法,3,Real Time PCR,解析方法,4,Real Time PCR,应用实例,Real Time PCR,基础知识1.,Real Time PCR,的用途及原理,2.,Real Time PCR,的检测方法,Real Time PCR,基础知识,1,Real Time PCR,的用途,Real Time PCR,用途,定性分析,定量分析,病毒及病原菌定量分析,导入基因拷贝数解析,GMO,定量检测,差异显示结果验证,基因芯片结果验证,siRNA,效果确认,mRNA,表达量分析,病毒及病原菌检测,物种鉴定,基因分型,绝对定量,相对定量,Real Time PCR,的原理,激发光,发射光,使用,Real Time PCR,扩增装置实时监测,PCR,扩增产物并进行分析的方法。,Real Time PCR,Ct,值,Real Time PCR,基础知识,1.,Real Time PCR,的用途及原理,2.,Real Time PCR,的检测方法,Real Time PCR,基础知识,1,TaqManProbe,Cycling,Probe,Molecular,Beacon,etc.,SYBR,Green I,荧光染料嵌合法,荧光探针法,Real Time PCR,的检测方法,荧光染料嵌合法（,SYBR Green I,）,SYBR Green I,：是一种能结合于所有,dsDNA,双螺旋小沟区域的,具有绿色激发波长的染料。,SYBR Green I,Primer,退 火,F,F,F,F,SYBR Green I,法,作用机理示意图,Pol.,F,Primer,Pol.,延 伸,F,F,F,F,F,F,Primer,热变性,F,F,F,F,TaqMan,法作用机理,TaqMan,探针为一寡核苷酸，,5,端标记一个报告基团（,Reporter,），,3,端标记一个淬灭基团（,Quencher,）。,R,Q,R,Q,Primer,R,Q,Primer,R,Q,Primer,Pol.,Pol.,热变性,退 火,延 伸,TaqMan Probe,法原理示意图,One-Step RT-PCR,特异性高,多重,PCR,检出,Probe,设计要求高,Probe,法,Probe,合成费用高,SYBR Green I,法与,Probe,法比较,常用于,mRNA,表达量分析等,SYBR Green I,法,简便易行,价格便宜,要求反应的特异性,不能进行多重,PCR,常用于,SNP,解析，病毒、病源菌检测,主 要 内 容,2,Real Time PCR,实验方法,反转录反应,Real Time PCR,反应,RT,Primer,的选择,Random Primer,Oligo dT Primer,Gene Specific Primer,Random 6mer Primer,Gene Specific Primer,Oligo dT Primer,PCR R-Primer,PCR F-Primer,目的片段在距,Poly(A)Tail 1.5 kbp,以内适用，,RT,效率较高。,One Step RT-PCR,只能使用,Gene Specific Primer,，但不适用于复数基因的检出。,5,3,Gene Specific Primer,目的片段,R,F,AAA,5,3,目的片段,R,F,1,500 base,Oligo dT Primer,Random,目的片段,5,3,R,F,目的片段在,mRNA,任何位置都能使用。通常,mRNA,表达量分析最适。,Oligo dT Primer,5,3,R,F,AAA,目的片段,Random,适用于,mRNA,表达量分析，提升反应检测的灵敏度。,RTPrimer,的选择,Real Time PCR,引物设计,目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格。,目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严格。,Real Time PCR,用引物与普通,PCR,引物设计要求不同,=,对引物设计要求严格,普通,PCR,引物,Real Time PCR,引物,两条引物的,Tm,值尽量接近，应用专用软件计算,Tm,值,Tm,值,40-60%(,最好,45-55%),GC,含量,Primer,长度,80-150 bp(,尽量限制在,300 bp,以内,),扩增片段大小,17-25 base,使用,BLAST,检索，确认引物特异性,特异性,引物内部或两条引物之间避免,3 base,以上的互补序列,引物,3,末端避免,2 base,以上的互补序列,互补性,3,末端序列,整体上碱基不能过偏,个别部分避免,GC rich,或,AT rich(,特别是,3,端,),避免,T/C,连续，,A/G,连续,序列,3,末端避免,GC rich,或,AT rich,3,末端碱基最好为,G,或,C,3,末端碱基尽量避免为,T,尽量在,Exon junction,上设计引物，限制基因组,DNA,扩增,RT-PCR,用引物,Real Time PCR,引物设计原则,探针的,Tm,比引物高,8-10,Tm,值,20-24 bp,Probe,长度,探针,5,末端的第一个碱基不能是,G,5,末端序列,目的序列,GC,含量相对较高的区域设计,整体上碱基不能过偏,个别部分避免,GC rich,或,AT rich(,特别是,3,端,),；避免,T/C,连续，,A/C,连续,序列,Probe,内部或,Probe,与两条引物之间避免,3 base,以上的互补序列,互补性,BLAST,检索确认,Probe,特异性,特异性,Real Time PCR,用,TaqMan,探针设计原则,Real Time PCR,探针设计原则,线性关系、扩增效率确认,检测灵敏度确认,PCR,扩增效率（,E,）：,0.8-1.2,35Cycles,内可得到好的定量结果。,如果采用,SYBR,检测方法，,30Cycles,内无非特异性产物扩增。,No,T,emplate,C,ontrol,确认,30Cycles,内无引物二聚体产生。,相关系数（,r,2,）：大于,0.98,反应性能确认,主 要 内 容,3,Real Time PCR,解析方法,1.标准曲线分析,2.融解曲线分析,3.绝对定量和相对定量解析方法,标准曲线制作,扩增曲线,标准曲线,标准品梯度的选择：,5,6,个梯度,标准品稀释倍数的选择：,标准品稀释倍数通常为,10,10,5,10,4,10,3,10,2,10,1,10,0,10,5,10,4,10,3,10,2,10,1,10,0,标准品的种类,基因组,DNA,质粒,Total RNA&cDNA,体外转录,RNA,DNA,样品定量标准品,RNA,样品定量标准品,质粒标准品构建流程,基因组,DNA,PCR,目的基因克隆,目的基因,目的基因,目的基因,质粒,质粒提取，,OD,值定量。将质粒梯度稀释至,10,5,-10,1,copies/ul,，作为标准品。,体外转录,RNA,标准品构建流程,RNA,纯化后，测,OD,定量。将,RNA,梯度稀释至,10,5,-10,1,copies/ul,，作为标准品。,T7 RNA polymerase,体外转录,RNA,Total RNA,PCR,cDNA,RT,T7 Promoter,TTTTT,PCR,产物,目的基因,目的基因,目的基因,AAAAA,AAAAA,理想的标准品扩增曲线,基线平整,Negative Control,为水平线,指数区较明显，陡度大,平台区汇于一起,线性范围宽,理想的标准曲线,相关系数（,r,2,）：大于,0.98,，越接近,1,，结果可信度越高。,扩增效率（,E,）：,0.8-1.2,，越接近,1,，越理想。,扩增效率,相关系数,扩增效率（,E,）计算方法,标准曲线,X,轴表示起始模板浓度（,log,10,),，,Y,轴表示,Ct,值时,E=10,-1/a,-1,标准曲线,X,轴表示,Ct,值，,Y,轴表示起始模板浓度（,log,10,),E=10,a,-1,Real Time PCR,解析方法,3,Real Time PCR,解析方法,1.标准曲线分析,2.融解曲线分析,3.绝对定量和相对定量解析方法,融解曲线分析,Tm,值是指双链,DNA,分子解链一半时的温度。,SYBR Green I,法进行检出时，,要根据融解曲线确认,PCR,产物的特异性。,特异性产物,非特异产物,引物二聚体,对,PCR,产物特异性进行分析,融解曲线分析,3,Real Time PCR,解析方法,1.标准曲线分析,2.融解曲线分析,3.绝对定量和相对定量解析方法,Real Time PCR,解析方法,绝对定量解析方法,提取样品,引物设计,标准品制备,Real Time PCR,反应,数据分析,流,程,绝对定量解析方法,通过制作标准曲线来确定样品的初始模板拷贝数或浓度。通常应用于病毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。,10,5,10,4,10,3,10,1,扩增曲线图,标准曲线图,检测样品,检测样品,10,2,相对定量解析方法,以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）校正，,进行相对表达量分析。,Sample B,Sample A,目的基因扩增效率相同,RNA,提取效率相同,细胞起始数相同,进行相对表达量分析必要性,实际上目的基因表达量分析,相对定量解析方法,管家基因,维持细胞基本代谢活动所必须的基因,如,：,GAPDH、-actin,等。,筛选方法,根据文献提供,通过具体实验筛选,主 要 内 容,Real Time PCR,基础知识,1,2,Real Time PCR,实验方法,3,Real Time PCR,解析方法,4,Real Time PCR,应用实例,对,SARS,病毒基因进行定量分析,绝对定量,相对定量,分析小鼠,PAH,基因在不同组织中的表达量变化,绝对定量应用例,对,SARS,样品中所含,SARS,病毒,RNA,进行定量,检测方法,TaqMan,probe,法,检测样品,3,个从,SARS,样品中提取的,Total RNA,目的基因,SARS,病毒,RNA,内 参,SARS Internal Control,RNA,标 准 品,SARS Control RNA,试 剂,One Step PrimeScript,RT-PCR Kit,（,Perfect Real Time,）（,DRR064,）,仪 器,Smart Cycler,SYN247 F02,SYN247R03,SYN247 F01,SYN247R02,SYN247R01,SYN247 F01,Bam,H,Hin,d,pBluescript II SK(+,)Vector,T7 Promoter,Bam,H,Hin,d,Sac,site,SARS Control RNA,构建,绝对定量应用例,对,SARS,培养液中所含SARS,病毒,RNA,进行定量,纯化的,SARS Control RNA OD,值测定结果,体外转录的,SARS Control RNA,电泳照片,M1 M2,M1:,-,Hin,d digest,M2:DL2,000 Marker,DNase I,处理前,DNase I,处理后,绝对定量应用例,对,SARS,样品中所含,SARS,病毒,RNA,进行定量,DNA,BNITMSARAs2 Adaptor R,Sac,site,Bam,Hsite,BNITMSARS1 Adaptor F,T7 Promoter,SARS Internal Control RNA,的构建,A,A,pBluescriptII,SK(+,)Vector,绝对定量应用例,对,SARS,样品中所含,SARS,病毒,RNA,进行定量,探针的选择,Template,Primer,TaqMan,Probe,5,端报告基团,3,端淬灭基团,SARS Control RNA,or SARS Genomic RNA,共用,FAM,标记,Eclipse,标记,SARS Internal Control RNA,共用,ROX,标记,Eclipse,标记,绝对定量应用例,对,SARS,样品中所含,SARS,病毒,RNA,进行定量,SARS Control RNA 10,5,-10,1,扩增曲线,SARS Genomic RNA Sample 1,、扩增曲线,SARS Internal Control RNA,扩增曲线,标准曲线,绝对定量应用例,对,SARS,样品中所含,SARS,病毒,RNA,进行定量,定量结果,对三个样品所含,SARS,病毒,RNA,进行了准确定量。,绝对定量应用例,对,SARS,样品中所含,SARS,病毒,RNA,进行定量,相对定量应用例,分析小鼠不同组织中,PAH,基因表达量的变化情况,检测方法,SYBR Green I,荧光嵌合法,管家基因,GAPDH,基因,目的基因,PAH,基因,标 准 品,cDNA,试 剂,PrimeScript RT,reagent Kit with gDNA Eraser,（,DRR047,）,SYBR,Premix Ex Taq,TM,II(Tli RNase H Plus),（,DRR820,）,仪 器,Thermal Cycler Dice,Real Time System,（,TP800,）,Total RNA,提取,Total RNA,基因组,DNA,去除,标准品,RNA,制备,标准曲线制作及预实验,详细的实验资料获取,实验设计及引物 设计、合成,样品,Real Time PCR,反应,相对定量计算及,数据分析,数据整理及论文撰写,相对定量应用例,分析小鼠不同组织中,PAH,基因表达量的变化情况,提取,Total RNA,后电泳照片,提取试剂TaKaRa RNAiso Plus,（,D9108,）,相对定量应用例,分析小鼠不同组织中,PAH,基因表达量的变化情况,M C L B M,M,：,DL2,000 DNA Marker,C,：,Control RNA,L,：,Liver RNA,B,：,Brain RNA,目的基因标准曲线制作结果,扩增曲线图,融解曲线图,标准曲线图,管家基因标准曲线制作结果,相对定量应用例,分析小鼠不同组织中,PAH,基因表达量的变化情况,扩增曲线图,样品目的基因定量结果,样品管家基因定量结果,管家基因,GAPDH,目的基因,PAH,定量结果,平均值,定量结果,平均值,通过,GAPDH,校正的,PAH校正值,小鼠肝脏和脑中,PAH,的相对表达量,样品,a1,228800,222175,196600,201175,0.905,3757,212700,204400,样品,a2,227300,207100,219900,196600,样品,b1,333600,340975,76.80,82.18,2.4110,-4,1,340300,92.65,样品,b2,354100,82.46,335900,76.80,相对定量应用例,分析小鼠不同组织中,PAH,基因表达量的变化情况,通过双标准曲线方法计算得出，苯丙氨酸羟化酶（,PAH,）基因在小,鼠肝脏中的表达量明显高于其在脑组织中的表达水平，二者的表达量比,例约为,3757,：,1,。,相对定量应用例,分析小鼠不同组织中,PAH,基因表达量的变化情况,Real Time PCR,试剂,使用,SYBR,Green I,法检测,使用探针法检测,使用荧光探针检测,使用,Cycling,探针检测,扩增的模板,GC,含量高,或含有重复序列,Real Time RT-PCR,试剂,使用,SYBR,Green I,法检测,使用探针法检测,使用荧光探针检测,使用,Cycling,探针检测,高质量的产品、完善的服务,High Quality Products&Rapid Reliable Service,Thank You!,