高效液相色谱分析法HPLC（High Pertormance Liquid Chromatography）.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,高效液相色谱法：,特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学,键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实,验技术建立的一种液相色谱分析法。,高压：,150-350*10,5,Pa,高效：大于,30000,塔板,/,米,高灵敏：,10,-9,g,（紫外检测）、,10,-11,g,（荧光检测）,第三章 高效液相色谱分析法,HPLC,（,High Pertormance Liquid Chromatography,，,）,2-1,高效液相色谱法的特点,一、,HPLC,与,GC,差别,1,分析对象的区别,GC,：适于能气化、热稳定性好、且沸点较,低的样品；但对高沸点、挥发性差、,热稳定性差、离子型及高聚物的样,品，尤其对大多数生化样品不可检测,占有机物的,20%,HPLC,：适于溶解后能制成溶液的样品（包括,有机介质溶液），不受样品挥发性和,热稳定性的限制，对分子量大、难,气化、热稳定性差的生化样品及高分,子和离子型样品均可检测,用途广泛，占有机物的,80%,2,流动相差别的区别,GC,：,流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用,力，只与固定相有相互作用。,HPLC,：,流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用,力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起,正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改,变流动相极性和,pH,值也对分离起到调控作用，当,选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相,也可以增大分离选择性。,3,操作条件差别,GC,：加温操作,HPLC,：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）,1,贮液罐（滤棒，可滤,去颗粒状物质）,2,高压泵（输液泵）,3,进样装置,4,色谱柱,分离,5,检测器,分析,6,废液出口或组分收集器,7,记录装置,二、高效液相色谱仪流程图,三、,HPLC,的特点和实际应用,1,、利用其高柱效（,n=10,4,片,/,米），有效分离极复杂,体系中的痕量组分。,正相色谱分离有机溶剂中的物质,反相色谱分离水溶液中的物质,生化物质。,2,、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对,色谱法分析离子型体的含量。（蛋白质、氨,基酸、常见阴阳离子等）,3,、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分,离高分子化合物。,4,、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化,合物。,2-2,基本理论和条件选择,基础,理论,热力学理论：塔板理论,平衡理论,动力学理论：速率理论,Vander,方程,一、塔板理论,1.,二、速率理论（与,GC,对比）,2,）涡流扩散项及其影响,2.,讨论：,1,）流动相流速对,HPLC,板高的影响（与,GC,对比）,3,）传质阻抗项及其影响,1,三、影响分离的因素,1.,固定相与装柱方法的选择：,选粒径小的、分布均匀的球形固定相,（,dp10m,）,首选化学键合相，匀浆法装柱,2.,流动相及其流速的选择：,选粘度小、低流速的流动相,甲醇，,约,1ml/min,3.,柱温的选择：,选室温,25,0,C,左右,四、,HPLC,法中分离条件的选择,一、液固吸附色谱法（,LSC,）,(liquid-solid adsorption chromatography),二、液液分配色谱法（,LLC,）,(liquid-liquid partition chromatography,chemical bonded phase chromatography,三、离子色谱法（,IC,）,（,ion-exchange chromatography and,ion pair chromatography),四、空间排阻色谱法（,SEC,）,（,steric exclusion chromatography,2-3,各类高效液相色谱法简介,1,分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附,活性中心能力的差异,分离前提：,K,不等或,k,不等,一、液固吸附色谱法（,LSC,）流动相为液体，固定相为固体吸附剂,2,固定相：与,LC,比，固定相粒径不同（,17%,分配色谱 硅胶失活,载体,吸附的水,固定液,1,分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异,2,固定相：载体,+,固定液（物理或机械涂渍法）,缺点：系统内部压力大，易流失，不实用,固定液,极性,NLLC,固定液,非极性,RLLC,3,正相色谱,固定液极性,流动相极性,（,NLLC,）,极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱,适于分离极性组分,反相色谱,固定液极性,固定相极性,底剂,+,有机调节剂（极性调节剂）,例：水,+,甲醇，乙腈，,THF,4,流动相极性与,k,的关系：,流动相极性,，洗脱能力,，,k,，,组分,t,R,5,出柱顺序：极性大的组分先出柱,极性小的组分后出柱,6,适用：非极性,中等极性组分（,HPLC80%,问题）,（三）正相键合相色谱,1,分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、,诱导力、或氢键作用力,2,固定相：极性大的氰基或氨基键合相,3,流动相：极性小（同,LSC,）,底剂,+,有机极性调节剂,例：正己烷,+,氯仿,-,甲醇，氯仿,-,乙醇,4,流动相极性与,k,的关系：,流动相极性,，洗脱能力,，,组分,t,R,，,k,5,出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先,出柱极性大的组分后出柱,6,适用：,氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）,分离物质也相似,氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性,分析极性大物质、糖类等,1,反相离子对色谱法（,IPC,或,PIC,）,反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分,与其中的反离子形成中性离子对，增加,k,和,t,R,，,以改善分离,1,）离子对试剂：烷基磺酸钠,分析碱,四丁基季胺盐,分析酸,2,）,影响,k,的因素,a,与,m,的极性有关（同反相色谱）,b,与,R,的链长有关：,R,长，极性,小，,t,R,，,k,3,）,适用：较强的有机酸、碱,三、离子色谱法（,IC,）,2,反相离子抑制色谱,在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相,pH,值，抑制,组分解离，增加其,k,和,t,R,，,以达到改善分离的目的,1,）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质,pH,一定的缓冲溶液,2,）,k,的影响因素：,与流动相极性有关，还与,pH,值有关,选择流动相：应同时考虑极性及,pH,值,酸性物质,加入酸,HAc,t,R,，,k,碱性物质,加入碱,NH,3,H,2O,t,R,，,k,调节,pH,范围：,3.08.0,pH8.0,破坏键合相与载体的结合,pH3.0,腐蚀柱子,3,）适用：极弱酸碱物质,pH=37,弱酸；,pH=78,弱碱；两性化合物,2,对流动相的要求：,1,）与固定液不反应,2,）对样品有良好溶解度,k=110,k=25,最理想的,3,）与检测器匹配：,UV,（,常用，测定波长应大于溶剂的截止波长）,荧光，电化学,4,）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈）,使用前过滤、脱气,3,洗脱方式,1,）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）,以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）,类似,GC,的等温度洗脱,2,）梯度洗脱：,在一定分析周期内不断变换流动相的种类,和比例,即不断改变其极性（两个泵）,适于分析极性差别较大的复杂组分,类似,GC,的程序升温（沸程较长样品）,2-4,高效液相色谱仪,1,泵：,恒压泵：流量精度不稳,恒流泵：常用,2,进样装置,1,）隔膜进样（高分子有机硅胶垫,进样室）,GC,系统压力较小，可以,HPLC,系统压力太大，必须停泵进样（早期）,2,）阀进样：不必停泵，六通阀,液相色谱,3,色谱柱：直径,46mm,柱长,1030cm,柱效评价：色谱系统适应性试验,R,，,n,，,f,s,（,拖尾因子）,柱再生：维护、保养、柱子的冲洗,4,检测器,1,）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质,2,）荧光检测器：只能分析自身发光的物质,灵敏度高,3,）示差折光检测器：利用折光率的差别,灵敏度低，温度要求严格,4,）电化学检测器,5,）化学发光,