高效液相色谱方法及应用（HPLC）课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,高效液相色谱方法及应用,(High Performance Liquid Chromatography,，,HPLC),1,、高效液相色谱法的原理,2,、高效液相色谱仪,3,、固定相和流动相,4,、色谱分离条件选择及定性定量分析,5,、高效液相色谱法的特点及应用,1,、高效液相色谱法的原理,1.1,高效液相色谱法的特点,1.1.1,与经典液相色谱法比较：,高速、高效、高灵敏度、高自动化,。,1.1.2,与气相色谱法比较,应用范围广、更利于选择最佳分离条件且可在常温下操作。,1.1.3,高效液相色谱法的特点,（,1,）分离效能高 （,2,）选择性高,（,3,）检测灵敏度高 （,4,）分析速度快,适合于高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。,1.2,高效液相色谱法的分类,按溶质在两相分离过程中的物理化学原理分类,1.2.1,吸附色谱（,Adsorption,Chromatography,）,1.2.2,分配色谱（,Partition Chromatography,）,1.2.3,离子色谱（,Ion Chromatography,）,1.2.4,体积排阻色谱（,Size Exclusion,Chromatography,）,1.2.5,亲和色谱（,Affinity Chromatography,）,分离过程物理化学原理分类的各种液相色谱法的比较,吸附色谱,分配色谱（键和相）,离子色谱（离子交换）,体积排阻色谱（凝胶）,亲和色谱,固定相,全多孔固体吸附剂,固定液载带在固相基体上,高效微粒离子交换剂,具有不同孔径的多孔性凝胶,多种不同性能的配位体键联在固相基体上,流动相,不同极性有机溶剂,不同极性有机溶剂和水,不同,pH,值的缓冲溶液,有机溶剂或一定,pH,值的缓冲溶液,不同,pH,值的缓冲溶液，可加入改性剂,分离原理,吸附与解吸,溶解与挥发,可逆性的离子交换,多孔凝胶的渗透或过滤,具有锁匙结构络合物的可逆性离解,1.3,基本原理,1.3.1,色谱过程,：,塔板理论、速率理论、定量定性方法。,1.3.2,色谱峰展宽的因素,(1),柱内展宽,1.,涡流扩散,A,。,2.,纵向扩散,B/u,。,3,传质阻力,Cu,。,(2),柱外展宽：降低柱效的重要原因,2,、高效液相色谱仪简介,高压输液系统：,储液罐、高压输液泵、过,滤器、压力脉动阻力器及梯度洗脱装置。,进样系统：,进样器，进样阀。,分离系统：,色谱柱，恒温箱。,检测系统记录系统：,检测器、记录装置,2.1,高压输液系统,2.1.1,贮液罐,2.1.2,流动相脱气,（,1,）吹氦脱气法,（,2,）加热回流法,（,3,）抽真空脱气法 （,4,）超声波脱气法,（,5,）在线真空脱气法,2.1.3,高压输液泵,（,1,恒流泵：输出恒定体积流量的流动相,（,2,）恒压泵：又称气动放大泵，输出恒定压力的泵。,2.1.4,输液系统的辅助设备,（,1,）,管道过滤器,（,2,）,脉动阻尼器,2.1.5,梯度洗脱装置,（,1,）,低压梯度（外梯度）,（,2,）高压梯度（内梯度）,（,3,）影响梯度洗脱的因素,2.2,进样系统,2.2.1,停流进样装置,2.2.2,六通阀进样装置,2.2.3,自动进样器,2.3.1,色谱柱是液相色谱的,心脏部件,，包括柱管与固定相。,柱管材料,:,玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。金属管用得较多。,色谱柱长,:,5,30cm,，,内径为,4,5mm,，,凝胶色谱柱内径,3,12mm,，,制备往内径较大，可达,25mm,以上。,分离前备有个,前置柱,:,前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离的性能不受影响,。,柱子装填,得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（,20m,）,一般采用,匀浆填充法装柱,，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。,2.3,分离系统,2.3.2,色谱柱：反相键合相色谱柱最常用的就是,ODS,柱，也就是,C18,柱。,常规柱、快速柱、微量色谱柱、制备柱和浓缩住。,2.3.3,柱温箱的温度控制要求比较精确，因为流体的粘度受温度的影响较大。,2.4,检测器,2.4.1,检测器的性能指标,（,1,）噪声,（,2,）基线漂移,（,3,）灵敏度,（,4,）线性范围,（,5,）检测器的池体积,2.4.2,检测器的种类,2.4.2.1,紫外吸收检测器,（,ultraviolet,visible detector,，,UVD,）,2.4.2.2,荧光检测器,（,fluorescence detector,，,FD,）,2.4.2.3,示差折光检测器,（,differential refractive Index detector,，,RID,）,2.4.2.4,电化学检测器,（,electron-chemical detector,，,ED,）,2.4.2.5,化学发光检测器,（,chemiluminescence,detector,，,CD,）,2.4.2.5,蒸发激光散射检测器（,ELSD,）,（通用灵敏的质量检测器）。,