试验肿瘤学基本概念.ppt

实验肿瘤学基本概念肿瘤发生发展的一般过程正常细胞正常细胞 癌细胞癌细胞 原位癌原位癌 浸润癌浸润癌 转移癌转移癌 休休 眠眠 预防预防 诊断诊断 治疗治疗肿瘤细胞的生物学特点肿瘤细胞的生物学特点自我满足的生长信号自我满足的生长信号 对生长抑制信号不敏感对生长抑制信号不敏感 逃避凋亡逃避凋亡 无限增殖的潜能无限增殖的潜能 血管生成血管生成 浸润和转移浸润和转移实验肿瘤模型的要求实验肿瘤模型的要求忠实地重现人类肿瘤的生物学特性忠实地重现人类肿瘤的生物学特性实验肿瘤学的研究方法实验肿瘤学的研究方法直接研究直接研究建立细胞系建立细胞系建立动物模型建立动物模型细胞系的基本概念细胞系的基本概念组组组组织织织织培培培培养养养养和和和和细细细细胞胞胞胞培培培培养养养养：模模模模拟拟拟拟体体体体内内内内环环环环境境境境在在在在体体体体外外外外培培培培养养养养机机机机体体体体组织和细胞，使之生存和生长。组织和细胞，使之生存和生长。组织和细胞，使之生存和生长。组织和细胞，使之生存和生长。原原原原代代代代培培培培养养养养（primary primary cultureculture）:从从从从体体体体内内内内取取取取出出出出组组组组织织织织和和和和细细细细胞胞胞胞的的的的第一次培养。第一次培养。第一次培养。第一次培养。传传传传代代代代（passagepassage）：细细细细胞胞胞胞长长长长满满满满培培培培养养养养瓶瓶瓶瓶后后后后，细细细细胞胞胞胞分分分分成成成成2-32-3瓶瓶瓶瓶继续培养。继续培养。继续培养。继续培养。细细细细胞胞胞胞系系系系（cell cell lineline）:原原原原代代代代培培培培养养养养细细细细胞胞胞胞首首首首次次次次传传传传代代代代成成成成功功功功后后后后的的的的细细细细胞胞胞胞，称称称称细细细细胞胞胞胞系系系系。Finite Finite cell cell line,line,continuous continuous cell cell line,line,established cell lineestablished cell line细细细细胞胞胞胞株株株株(cell(cell strain):strain):通通通通过过过过选选选选择择择择或或或或克克克克隆隆隆隆，从从从从亲亲亲亲代代代代细细细细胞胞胞胞系系系系选选选选出出出出的带有特定标志的细胞群。的带有特定标志的细胞群。的带有特定标志的细胞群。的带有特定标志的细胞群。瘤株：在动物体内可传代的肿瘤细胞系。瘤株：在动物体内可传代的肿瘤细胞系。瘤株：在动物体内可传代的肿瘤细胞系。瘤株：在动物体内可传代的肿瘤细胞系。ATCC American Type Culture Collection ATCC American Type Culture Collection 美国模式培养美国模式培养物收集中心物收集中心,美国菌种保存中心美国菌种保存中心培养细胞的生长方式贴附生长型细胞贴附生长型细胞：细胞附着于支持物表面生长。：细胞附着于支持物表面生长。上上皮皮细细胞胞型型：来来源源于于外外胚胚层层和和内内胚胚层层的的细细胞胞，细细胞为扁平多角形，细胞之间紧密相靠成片。胞为扁平多角形，细胞之间紧密相靠成片。成成纤纤维维细细胞胞型型：来来源源于于中中胚胚层层的的细细胞胞，细细胞胞呈呈梭梭形，排列成漩状、放射状、栅栏状。形，排列成漩状、放射状、栅栏状。悬浮生长型悬浮生长型：造血系统的细胞：造血系统的细胞培养细胞的生长特点贴贴附附生生长长：支支持持物物可可为为玻玻璃璃、塑塑料料、胶胶原原、其其他他细细胞胞等等。停停泊泊或或贴贴壁壁依依赖赖性性细细胞胞（anchorage-anchorage-dependent celldependent cell)接接触触抑抑制制(contact contact inhibitioninhibition)：正正常常细细胞胞相相互互接接触触后后，细细胞胞将将向向另另一一个个方方向向移移动动，从从而而使使细细胞胞不不会会重重叠叠生长。生长。密密度度抑抑制制(density(density inhibition)inhibition)：正正常常细细胞胞汇汇合合成成片片后后细细胞胞分分裂裂停停止止，在在静静止止状状态态下下细细胞胞存存活活一一段段时时间间 汇合汇合 confluentconfluent培养条件培养条件基基基基 本本本本 营营营营 养养养养 成成成成 分分分分 RPMI1640 RPMI1640 DMEM DMEM(Dulbeccos(Dulbeccos modified modified Eagle Eagle medium)medium)谷谷谷谷氨酰胺氨酰胺氨酰胺氨酰胺生生生生长长长长因因因因子子子子 小小小小牛牛牛牛血血血血清清清清 胎胎胎胎牛牛牛牛血血血血清清清清 灭灭灭灭活活活活补补补补体体体体 5656 30min 30min 环境环境环境环境 3737 pH 7.2-7.4 pH 7.2-7.4 渗透压渗透压渗透压渗透压 无污染无毒无污染无毒无污染无毒无污染无毒 细菌、细菌、细菌、细菌、支原体支原体支原体支原体 体外培养的优点体外培养的优点优点：优点：优点：优点：1.1.活细胞，活细胞，活细胞，活细胞，2.2.对对对对象象象象均均均均匀匀匀匀，易易易易控控控控制制制制实实实实验验验验条条条条件件件件，易易易易于于于于观观观观察察察察和和和和纪纪纪纪录录录录实验结果实验结果实验结果实验结果 3.3.易易易易研研研研究究究究单单单单个个个个细细细细胞胞胞胞的的的的结结结结构构构构和和和和功功功功能能能能，易易易易于于于于进进进进行行行行分分分分子子子子生物学水平研究，生物学水平研究，生物学水平研究，生物学水平研究，4.4.实验周期短，成本低，细胞系可长期保存。实验周期短，成本低，细胞系可长期保存。实验周期短，成本低，细胞系可长期保存。实验周期短，成本低，细胞系可长期保存。体外培养的缺点体外培养的缺点 1.1.在体外细胞生物学行为与在体内不完全一样，在体外细胞生物学行为与在体内不完全一样，在体外细胞生物学行为与在体内不完全一样，在体外细胞生物学行为与在体内不完全一样，G1 G0 G1 G0 终末分化终末分化终末分化终末分化肿瘤细胞肿瘤细胞肿瘤细胞肿瘤细胞 M SM S介质细胞介质细胞介质细胞介质细胞 G2G22.2.转转转转化化化化（transformationtransformation）:在在在在体体体体外外外外培培培培养养养养过过过过程程程程中中中中细细细细胞胞胞胞的的的的遗遗遗遗传传传传性性性性状状状状发发发发生生生生变变变变化化化化。分分分分为为为为一一一一般般般般转化和恶性转化。转化和恶性转化。转化和恶性转化。转化和恶性转化。一般转化一般转化一般转化一般转化：指细胞获得不死性。：指细胞获得不死性。：指细胞获得不死性。：指细胞获得不死性。恶恶恶恶性性性性转转转转化化化化：指指指指出出出出现现现现在在在在软软软软琼琼琼琼脂脂脂脂培培培培养养养养基基基基中中中中浸浸浸浸 润润润润生生生生长长长长；在在在在动动动动物物物物体体体体内内内内成成成成瘤瘤瘤瘤；血血血血清清清清依依依依赖赖赖赖性性性性降降降降低；生长密度依赖性降低。低；生长密度依赖性降低。低；生长密度依赖性降低。低；生长密度依赖性降低。3.3.体外实验结果不能外推到体内实验体外实验结果不能外推到体内实验体外实验结果不能外推到体内实验体外实验结果不能外推到体内实验细胞培养的应用细胞培养的应用研究细胞与环境的相互作用研究细胞与环境的相互作用细胞间的相互作用细胞间的相互作用细胞内胞质活动细胞内胞质活动细胞质与细胞核之间的流动细胞质与细胞核之间的流动建立细胞系的基本要求建立细胞系的基本要求细胞在体外培养半年以上，生长稳定，保细胞在体外培养半年以上，生长稳定，保持细胞特征并能传代。持细胞特征并能传代。建系方法建系方法1.1.原原原原代代代代培培培培养养养养：无无无无菌菌菌菌操操操操作作作作，取取取取肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤组组组组织织织织，切切切切成成成成小小小小片片片片，小小小小于于于于0.50.5毫毫毫毫米米米米，进进进进行行行行培培培培养养养养，或或或或用用用用胰胰胰胰酶酶酶酶、胶胶胶胶原原原原酶酶酶酶消消消消化化化化成成成成单单单单细细细细胞胞胞胞悬悬悬悬液液液液，血清灭活酶，培养血清灭活酶，培养血清灭活酶，培养血清灭活酶，培养2.2.传代传代传代传代：待细胞长满培养瓶，胰酶消化，按：待细胞长满培养瓶，胰酶消化，按：待细胞长满培养瓶，胰酶消化，按：待细胞长满培养瓶，胰酶消化，按1 1：2-32-3传代传代传代传代3.3.去除杂细胞去除杂细胞去除杂细胞去除杂细胞4.4.冻存细胞冻存细胞冻存细胞冻存细胞 10%DMFO+90%10%DMFO+90%胎牛血清，胎牛血清，胎牛血清，胎牛血清，4 4 30min,30min,-20-20 2hrs,2hrs,2hrs,2hrs,-70-70-70-70 过过过过夜夜夜夜,液液液液氮氮氮氮，长长长长期保存。期保存。期保存。期保存。登记，定期复苏细胞。登记，定期复苏细胞。登记，定期复苏细胞。登记，定期复苏细胞。复苏：复苏：复苏：复苏：37 37 37 37 水浴，加培养基洗一次，培养水浴，加培养基洗一次，培养水浴，加培养基洗一次，培养水浴，加培养基洗一次，培养 5.5.鉴定鉴定鉴定鉴定鉴 定细胞形态观察细胞形态观察细胞形态观察细胞形态观察 癌细胞多角型，重叠生长，癌细胞多角型，重叠生长，癌细胞多角型，重叠生长，癌细胞多角型，重叠生长，核浆比例失调，多核巨细胞核浆比例失调，多核巨细胞核浆比例失调，多核巨细胞核浆比例失调，多核巨细胞染色体分析染色体分析染色体分析染色体分析 数量和核型、核带，标记染色体数量和核型、核带，标记染色体数量和核型、核带，标记染色体数量和核型、核带，标记染色体细胞生长曲线和细胞周期细胞生长曲线和细胞周期细胞生长曲线和细胞周期细胞生长曲线和细胞周期集落形成率集落形成率集落形成率集落形成率动物接种动物接种动物接种动物接种 成瘤，成瘤，成瘤，成瘤，组织形态学与原发肿瘤相似组织形态学与原发肿瘤相似组织形态学与原发肿瘤相似组织形态学与原发肿瘤相似污染污染污染污染 无病毒、无病毒、无病毒、无病毒、支原体污染支原体污染支原体污染支原体污染、细胞间交叉污染细胞间交叉污染细胞间交叉污染细胞间交叉污染 Hela cell:1951Hela cell:1951年年年年 Henrietta Lack Henrietta Lack 宫颈癌宫颈癌宫颈癌宫颈癌 实验动物基础知识实验动物基础知识法法 规规19881988年年年年 中华人民共和国实验动物管理条例中华人民共和国实验动物管理条例中华人民共和国实验动物管理条例中华人民共和国实验动物管理条例19891989年年年年 医学实验动物管理实施细则医学实验动物管理实施细则医学实验动物管理实施细则医学实验动物管理实施细则19941994年年年年 关关关关于于于于在在在在全全全全国国国国医医医医疗疗疗疗卫卫卫卫生生生生系系系系统统统统实实实实行行行行实实实实验验验验动动动动物物物物合合合合格格格格证证证证制制制制度度度度得得得得通通通通知知知知 （医医医医学学学学实实实实验验验验动动动动物物物物合合合合格格格格证证证证书书书书，医医医医学学学学实实实实验验验验动动动动物物物物环环环环境境境境设设设设施施施施合合合合格格格格证证证证书书书书，医医医医学学学学实实实实验验验验动动动动物物物物全全全全价价价价营营营营养养养养饲饲饲饲料料料料合合合合格格格格证证证证书书书书，医学实验动物饲料生产条件合格证书医学实验动物饲料生产条件合格证书医学实验动物饲料生产条件合格证书医学实验动物饲料生产条件合格证书）19881988年年年年 广东省实验动物管理办法广东省实验动物管理办法广东省实验动物管理办法广东省实验动物管理办法基本概念基本概念 实实实实验验验验动动动动物物物物（laboratory laboratory animalanimal）:指指指指人人人人工工工工培培培培育育育育的的的的、对对对对其其其其携携携携带带带带微微微微生生生生物物物物实实实实行行行行控控控控制制制制、来来来来源源源源清清清清楚楚楚楚、遗遗遗遗传背景清晰、可用于科学实验得动物。传背景清晰、可用于科学实验得动物。传背景清晰、可用于科学实验得动物。传背景清晰、可用于科学实验得动物。实实实实验验验验用用用用动动动动物物物物（animal animal for for researchresearch）:能能能能用用用用于于于于科科科科学学学学实实实实验验验验的的的的动动动动物物物物，包包包包括括括括实实实实验验验验动动动动物物物物、野野野野生生生生动动动动物物物物、经济动物和观赏动物。经济动物和观赏动物。经济动物和观赏动物。经济动物和观赏动物。标标标标准准准准化化化化实实实实验验验验动动动动物物物物：有有有有明明明明确确确确的的的的遗遗遗遗传传传传背背背背景景景景、繁繁繁繁殖殖殖殖方方方方法法法法、饲饲饲饲养养养养环环环环境境境境、饲饲饲饲料料料料成成成成分分分分均均均均达达达达到到到到标标标标准准准准的的的的实实实实验验验验动动动动物。在科学研究中必须使用标准化实验动物。物。在科学研究中必须使用标准化实验动物。物。在科学研究中必须使用标准化实验动物。物。在科学研究中必须使用标准化实验动物。实验动物的分类实验动物的分类(遗传背景遗传背景)近近近近交交交交系系系系（纯纯纯纯系系系系）：连连连连续续续续2020代代代代以以以以上上上上兄兄兄兄妹妹妹妹交交交交配配配配或或或或亲亲亲亲子子子子交交交交配配配配 而获得的遗传上达到一致的动物群。如而获得的遗传上达到一致的动物群。如而获得的遗传上达到一致的动物群。如而获得的遗传上达到一致的动物群。如BLAB/cBLAB/c小鼠。小鼠。小鼠。小鼠。杂杂杂杂交交交交群群群群:两两两两个个个个近近近近交交交交系系系系动动动动物物物物间间间间有有有有计计计计划划划划进进进进行行行行交交交交配配配配获获获获得得得得的的的的第第第第一一一一代动物。代动物。代动物。代动物。封封封封闭闭闭闭群群群群：由由由由同同同同一一一一血血血血缘缘缘缘品品品品系系系系进进进进行行行行自自自自由由由由交交交交配配配配，在在在在固固固固定定定定场场场场所所所所保存繁殖保存繁殖保存繁殖保存繁殖5 5年以上得动物群，如年以上得动物群，如年以上得动物群，如年以上得动物群，如Wistar Wistar 大鼠、大鼠、大鼠、大鼠、SDSD大鼠。大鼠。大鼠。大鼠。突突突突变变变变系系系系：正正正正常常常常染染染染色色色色体体体体基基基基因因因因突突突突变变变变导导导导致致致致遗遗遗遗传传传传缺缺缺缺陷陷陷陷的的的的动动动动物物物物，如裸鼠如裸鼠如裸鼠如裸鼠按微生物控制分类按微生物控制分类一级一级一级一级：普通动物，不携带人畜共患疾病病原体的动物。：普通动物，不携带人畜共患疾病病原体的动物。：普通动物，不携带人畜共患疾病病原体的动物。：普通动物，不携带人畜共患疾病病原体的动物。二二二二级级级级：清清清清洁洁洁洁动动动动物物物物，不不不不携携携携带带带带人人人人畜畜畜畜共共共共患患患患疾疾疾疾病病病病病病病病原原原原体体体体和和和和动动动动物物物物传传传传染染染染病病原体的动物。病病原体的动物。病病原体的动物。病病原体的动物。三三三三 级级级级：无无无无 特特特特 定定定定 病病病病 原原原原 体体体体 的的的的 动动动动 物物物物（specific specific pathogen pathogen free,SPFfree,SPF）,动动动动物物物物体体体体内内内内不不不不存存存存在在在在特特特特定定定定病病病病原原原原微微微微生生生生物物物物和和和和寄寄寄寄生生生生虫虫虫虫的实验动物。的实验动物。的实验动物。的实验动物。四级四级四级四级：无菌动物，不存在微生物和寄生虫的实验动物。：无菌动物，不存在微生物和寄生虫的实验动物。：无菌动物，不存在微生物和寄生虫的实验动物。：无菌动物，不存在微生物和寄生虫的实验动物。一一一一级级级级动动动动物物物物只只只只能能能能用用用用于于于于教教教教学学学学和和和和某某某某些些些些研研研研究究究究的的的的预预预预实实实实验验验验，卫卫卫卫生生生生部部部部以以以以上课题和研究生课题必须使用二级以上动物上课题和研究生课题必须使用二级以上动物上课题和研究生课题必须使用二级以上动物上课题和研究生课题必须使用二级以上动物免疫缺陷动物免疫缺陷动物裸小鼠（裸小鼠（nude mice）19621962年英国发现。鼠年英国发现。鼠年英国发现。鼠年英国发现。鼠1111号染色体裸基因号染色体裸基因号染色体裸基因号染色体裸基因nunu是隐性突变基因。是隐性突变基因。是隐性突变基因。是隐性突变基因。裸基因纯合子（裸基因纯合子（裸基因纯合子（裸基因纯合子（nu/nunu/nu）鼠的特征）鼠的特征）鼠的特征）鼠的特征:1.1.全身无毛，裸体外表。全身无毛，裸体外表。全身无毛，裸体外表。全身无毛，裸体外表。2.2.胸腺上皮细胞不能增殖，胸腺上皮细胞不能增殖，胸腺上皮细胞不能增殖，胸腺上皮细胞不能增殖，T T细胞发育受阻，细胞发育受阻，细胞发育受阻，细胞发育受阻，T T细胞免疫缺陷细胞免疫缺陷细胞免疫缺陷细胞免疫缺陷。3.B 3.B 细细细细胞胞胞胞形形形形态态态态正正正正常常常常，功功功功能能能能较较较较差差差差，免免免免疫疫疫疫球球球球蛋蛋蛋蛋白白白白以以以以 Ig Ig M M 为为为为主主主主，少少少少量量量量Ig G Ig G，类似于人原发细胞免疫缺陷。，类似于人原发细胞免疫缺陷。，类似于人原发细胞免疫缺陷。，类似于人原发细胞免疫缺陷。随着鼠龄增加，随着鼠龄增加，随着鼠龄增加，随着鼠龄增加，T T细胞增加，移植实验一般用细胞增加，移植实验一般用细胞增加，移植实验一般用细胞增加，移植实验一般用4-84-8周鼠。周鼠。周鼠。周鼠。4.4.裸裸裸裸小小小小鼠鼠鼠鼠抵抵抵抵抗抗抗抗力力力力差差差差，易易易易患患患患病病病病毒毒毒毒性性性性肝肝肝肝炎炎炎炎和和和和肺肺肺肺炎炎炎炎，应应应应饲饲饲饲养养养养在在在在SPF SPF 环境。环境。环境。环境。5.5.纯纯纯纯合合合合型型型型雌雌雌雌鼠鼠鼠鼠不不不不能能能能生生生生育育育育，/nu/+/nu/+/nu/+/nu/+和和和和/nu/nu/nu/nu/nu/nu/nu/nu交交交交配配配配可可可可获获获获 1/2 1/2 1/2 1/2 纯合子鼠。纯合子鼠。纯合子鼠。纯合子鼠。常用常用常用常用BALB/c nu/nu,Swiss nu/nu,NC nu/nu BALB/c nu/nu,Swiss nu/nu,NC nu/nu。应 用建立人肿瘤的裸鼠移植瘤模型 研究致癌机理：1在裸鼠体内诱发人类肿瘤：EBV 2生物因素的致瘤性：多瘤病毒只在新生鼠或幼鼠诱发肿瘤，而在成年裸鼠也可在远离注射部位诱发肿瘤，在雌鼠为乳腺癌，雄鼠为骨肉瘤。裸大鼠(nude rat)1953年苏格兰在远交系hooded大鼠中发现，因饲养不当而绝种。1975年重新发现纯合子大鼠。纯合子 rnu/rnu 鼠无胸腺，缺乏功能性T细胞，抵抗力低下。严重联合免疫缺陷鼠(severe combined immune deficiency mice,SCID)1982年美国发现于C.B-17/ICR品系。Scid位于16号染色体，是隐性突变基因。纯合子scid/scid T细胞和B细胞功能缺陷，血清中无免疫球蛋白，外周血淋巴细胞数量明显减少。NK 细胞功能正常。接受单克隆抗体杂交瘤移植后易形成腹水瘤，可获得高纯度的单克隆抗体。SCID 鼠被毛发正常，雌雄可生育。动物肿瘤模型自发肿瘤：动物自然发生的肿瘤，发病过程与人类肿瘤相似，但发病时间早晚不一，不易在短期内得到实验结果。诱发肿瘤：用化学、物理、生物等因素在动物体内诱发的肿瘤。物理、生物因素诱发肿瘤的潜伏期长，发生率不稳定，常用化学因子诱发肿瘤。常用于肿瘤病因、化学预防的研究诱发肿瘤模型的基本要求简单易行、易重复选择对特定致癌物敏感的动物种系：多环方香烃-皮肤/小鼠；甲基卞肼亚硝胺-食道癌/大鼠；甲基氨基偶氮苯-肝癌/大鼠恰当的致癌物剂量：动物存活率高，诱发周期短。诱发的肿瘤类似于人类肿瘤原原位位诱诱发发：如如：0.250.25二二已已基基亚亚硝硝胺胺 0.250.251 1 ml ml 灌胃灌胃6 6月，月，7070发生肝癌发生肝癌异异位位诱诱发发：将将与与致致癌癌物物作作用用过过的的器器官官或或组组织织移移植植于于自自体体或或同同系系、同同基基因因正正常常动动物物皮皮下下，诱诱发发所所需需的的肿肿瘤瘤。如如：甲甲基基胆胆蒽蒽穿穿线线法法穿穿入入幼幼鼠鼠子子宫宫颈颈，将将子子宫宫颈颈切切除除，移移植植于于同同系系成成年年小小鼠鼠皮皮下下，3 3个个月月后诱发异位子宫颈癌后诱发异位子宫颈癌可移植性肿瘤 肿瘤组织在同种或异种动物体内传代后获得的生物学特性学相对稳定的肿瘤。同种可移植性肿瘤同种可移植性肿瘤 可分为实体瘤、腹水瘤、淋可分为实体瘤、腹水瘤、淋巴瘤、白血病巴瘤、白血病 到到19971997年我国年我国6565株。株。腹水瘤：将可移植性实体瘤接种于同种动物腹腹水瘤：将可移植性实体瘤接种于同种动物腹腔或腹壁，待肿瘤生长后形成腹水，再接接种腔或腹壁，待肿瘤生长后形成腹水，再接接种于同系肿瘤。用于药物筛选。于同系肿瘤。用于药物筛选。异种可移植性瘤异种可移植性瘤：免免疫疫力力正正常常动动物物：免免疫疫隔隔离离区区 如如眼眼前前房房、脑脑内内，或或免免疫疫抑抑制制，如如X X线线照照射射/可可的的松松 免疫缺陷动物免疫缺陷动物 移植部位原位移植（orthotopic implantation）异位移植(ectopic implantation)皮下、肾包膜下、腹腔可移植性肿瘤的参考标准传15-20代以上接种成活率100%，自发消消退率2年)的状态,此时肿瘤细胞处于G0期或增殖和凋亡相平衡。微小转移灶（micro-metastasis）:在原发灶以外用常规临床检查方法不能发现的肿瘤病灶微小残留灶：治疗后在原发灶遗留的小量肿瘤细胞转基因动物肿瘤模型理论基础：1 肿瘤是癌基因突变/抑癌基因失活的结果 2 基因功能在进化中是保守的 转基因动物外源基因在动物染色体稳定整合并遗传给后代的动物。用途：生物医药 基因表达调控 单基因表达调控 多基因表达调控 基因敲除（knock out)转基因方法 DNA 逆转录病毒/DNA转染 胚胎干细胞 显微注射受精卵 四细胞胚胎 囊胚 原肠胚 转基因动物 显微注射 逆转录病毒DNA DNA纤维注射与逆转录病毒转染的比较纤维注射与逆转录病毒转染的比较转基因方式转基因方式 显微注射显微注射 逆转录病毒转染逆转录病毒转染DNADNA导入导入 50kb,50kb,单细胞受精卵单细胞受精卵 10-15kb,4610-15kb,46细胞细胞卵卵培养液培养液 M16 M16 高营养液高营养液移卵移卵 输卵管输卵管 子宫子宫整合整合 随机整合，多拷贝随机整合，多拷贝 随机整合，嵌合体，随机整合，嵌合体，单拷贝单拷贝表达表达 受旁侧序列影响受旁侧序列影响 受病毒受病毒LTRLTR影响，影响，在一定范围内表达水平在一定范围内表达水平 易缺失易缺失 与拷贝数成正比与拷贝数成正比传代传代 可传代可传代 整合至生殖细胞的可传整合至生殖细胞的可传代代显微注射法建立转基因鼠的一般实验程序显微注射法建立转基因鼠的一般实验程序 供体母鼠供体母鼠 注射激素、注射激素、交配交配 鼠受精卵鼠受精卵目的基因目的基因 显微注射显微注射 注射注射DNADNA的受精卵的受精卵 假孕母鼠假孕母鼠 娩出幼鼠娩出幼鼠 鉴定鉴定C57BL/6肝癌模型p53-/-+p53+/+HBV+p53+/-HBV+p53+/+p53-/-+p53+/+HBV+p53+/-HBV+p53+/+p53+/-HBV+P53+/-HBV-p53+/+HBV+P53+/+HBV-p53+/-HBV+P53+/-HBV-p53+/+HBV+P53+/+HBV-AFB1 10mg/kg i.p AFB1 10mg/kg i.pGroup HBV p53 AFB1 SEX N HCCGroup HBV p53 AFB1 SEX N HCC Ia +/-+M 7 Ia +/-+M 7 7/77/7 +/-+F 8 +/-+F 8 5/85/8 IIa +/+M 16 IIa +/+M 16 11/1611/16 +/+F 6 0/6 +/+F 6 0/6 IIIa -+/-+M 7 2/7 IIIa -+/-+M 7 2/7 -+/-+F 9 1/9 -+/-+F 9 1/9 IVa -+/+M 10 1/10 IVa -+/+M 10 1/10 -+/+F 7 0/7 -+/+F 7 0/7 Ib +/-M 8 1/8 Ib +/-M 8 1/8 IIb +/+-F 5 0/5 IIb +/+-F 5 0/5