超氧化物歧化酶(SOD)生产.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2015/12/4,#,项目二：超氧化物歧化酶（SOD）的生产,一.,SOD,的概况,1,.超氧化物歧化酶（,SOD,）的概念：,超氧化物歧化酶,是一种广泛存在于动物、植物、微生物中的,金属酶,，是,生物体内抗氧化酶,系中主要成员之一,。,2,.,SOD,的分类,按其结合的,金属,离子,（即,金属,辅基,的,成分）可,分为：,（,1,）,Fe-SOD,（,2,）,Mn-SOD,（,是,SOD,酶分子内所含金属离子,Mn,2,+,）,（,3,）,Cu-Zn-SOD,（铜锌超氧化物）,3,.SOD,的理化,性质,31,SOD,对氰化物和,H2O2,的,敏感性：,长时间用过氧化氢处理可使,CuZn-SOD,和,Fe-SOD,失活，而,Mn-SOD,不受影响,3.2 SOD,的吸收光谱,特性：,CuZn-SOD,具有独特的紫外吸收光谱。由于色氨酸和酪氨酸的含量较低，它在,280,nm,处并没有最大吸收峰,。,CuZn-SOD,的可见光最大吸收波长都在,680,nm,左右，这反映了酶分子中,Cu,2+,的光学特性。,3.3 SOD,稳定性及影响因素,：,（,1,）,PH,、,热、蛋白酶的影响：,SOD,在,pH5.39.6,间催化性能良好，在,pH4.5pH11,间能稳定存在。,pH3.6,时，,CuZn-SOD,中95%的,Zn,要脱落，在,pH12.2,时，,SOD,的构象会发生不可逆的转变而使酶失活。,（,2,）,SOD,对热的稳定性与溶液中离子强度有关。当离子强度很低时,即使加热到95,其活性损失也很少其他因素：,SOD,活性受饮料的色泽、成分、酸碱度、乙醇含量等多种因素的影响，只有在无色、近中性、无乙醇饮料中,SOD,活性较稳定。另外还发现有机溶剂和,Cl,对,SOD,的活性具,抑制作用。,4.SOD,的作用,它催化超氧阴离子转化为,H2O2,和,O2,的反应，即催化超氧阴离子自由基,O2-,发生歧化反应，从而清除,O2-,，2O2-,+2H+H2O2+O2，,在生命体的自我保护系统中起着极为重要的作用，在免疫系统中也有重要的功，因而它能防御氧毒性，增强机体抗辐射损伤能力，防衰老。,SOD,的主要功能是：清除体内多余的自由基，延缓由于自由基侵害而出现的衰老现象，提高人体抵抗自由基诱发疾病的能力，能抗疲劳、甚至抗肿瘤。,二,SOD,的,运用,1.药物,SOD,是一种新型的抗炎症药，,根据,SOD,作用机制和毒性试验,，它对治疗因,O2-,引起的各种,疾病都有一定的疗效。为此，,SOD,可作为抗衰老、抗炎症、自身免疫疾病患者广泛应用的医药品。此外，,SOD,对治疗贝切特氏症、心肌梗塞等血虚性心脏病、胶原病、新生儿呼吸困难综合症、防御放射性伤害等也可望有效。,2.添加剂,国外不少高级化妆品都添加,SOD，,国内也有数家工厂或公司在开发和生产,SOD,化妆品，如大宝,SOD,密，康妮,SOD、SOD,康舒达霜剂等。,SOD,作为化妆品添加剂主要有3个优点：,（1）有明显的防晒效果,（2）可防皮肤衰老，阻止紫褐质（老年斑）的形成,（3）有明显的抗炎效果，对防治皮肤病有一定效果,。,国外把,SOD,作为食品添加剂,的例子是加在口香糖和饮料中。我国贵州农学院已开发出刺梨,SOD,饮料。,SOD,及修饰过的,SOD,还可作为外用药膏、眼药及牙膏等的添加剂,。,3.生化试剂,国外已有数家公司如,Sigma,公司等出售,SOD,试剂，国内也有厂家批量生产,SOD,试剂，如,中科院上海生化所东风试剂厂,、南京建成生物工程研究所等。此外，,SOD,有可能作为某些疾病的探针，如郭彦等人认为脑瘤组织线粒体,Mn-SOD,降低是转化细胞的可靠生化指标之一，并可作为评估脑瘤分化程度的参考。,随着,人们对,SOD,更广泛深入的研究，不同类型,SOD、SOD,修饰物及人工有机合成,SOD,模拟酶将在医疗、保健、食品、农业增产等方面发挥出更大的作用。,三.,SOD,的生产,仪器、试剂和材料：,-,研钵,，石英砂，烧杯（,50mL,），玻璃棒，,pH,计，冷冻离心机，离心管,-,新鲜蒜瓣,-,0.05mol/L,磷酸缓冲溶液（,pH7.8,），氯仿,-,乙醇混合液（氯仿,-,无水乙醇,3,5,），丙酮（用前预冷至,-10,）。,提取,SOD,酶,去除杂蛋白,SOD,酶的沉淀分离,离心纯化,超滤浓缩,测定蛋白含量,冷冻干燥后得成品,生产流程：,操作,步骤：,整个操作过程在,0,到,5,条件下进行,。,（,1,）,SOD,酶的提取 称取,5g,大蒜蒜瓣，加入石英研磨破碎细胞后，加入,0.05mol/L,的磷酸缓冲液（,Ph7.8,）,15ml,，继续研磨,20min,，使,SOD,酶充分溶解到缓冲液中，然后,6000r/min,冷冻离心,15min,，弃沉淀，取上清液,。,（,2,）去除杂蛋白 上清液中加入,0.25,倍体积的氯仿,-,乙醇混合液搅拌,15min,，,6000r/min,离心,15min,，弃去沉淀，得到的上清液即为粗酶液。,（,3,）,SOD,酶的沉淀分离 粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌,15min,，,6000/min,离心,15min,，得到,SOD,酶,沉淀。,（,4,）将,沉淀溶入,pH7.8,，,0.05mol/L,的磷酸缓冲液,5mL,中，然后,6000r/min,离心,15min,，放弃沉淀，取上清液，用凝胶,sephacylS-200,进行纯化，然后超滤浓缩。,（,5,）用,紫外分光光度计测定浓液的蛋白含量,（,6,）将,浓缩冷冻干燥后即得成品。,四、,SOD,酶的检验,原理：,连苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出氧气，生成带色的中间产物。在自氧化过程的初始阶段，黄色中间产物的积累在滞后,3045s,后就与时间成线性关系。中间产物在,420nm,处有强烈的光吸收，在有,SOD,存在时由于它能催化生成氧气与过氧化氢，从而阻止了中间物的积累，通过计算就可以求出,SOD,的活力,。,所需溶液的配制：,（,1,）,pH,值为,8.30,的,50mol/LK,2,HPO,4,-KH,2,PO,4,缓冲溶液：,25,下,96.5mL 1mol/L,的,LK,2,HPO,4,与,3.5mL 1mol/L,的,KH,2,PO,4,混合后，用水稀释至,2000mL,。,（,2,）,0.05mol/L,连苯三酚,溶液：称取,3.15g,连苯三酚用,0.01mol/L,盐酸溶液溶解并定容至,500mL,。,2,、酶活性的,测定：,（,1,）连苯三酚自氧化速率的测定,在,10ml,试管中加入,pH,值为,8.30,的,50mol/LK,2,HPO,4,-KH,2,PO,4,缓冲溶液,4.50ml,，在,250.5,的恒温水浴中保温,10min,，然后加入在,250.5,的恒温水浴中事先预热好的连苯三酚溶液（空白管用,10mmol/L HCL,代替），迅速摇匀倒入,1cm,比色皿中，以空白管为参比，在,325nm,下，每隔,30s,测,1,次吸光值，连续记录,3min,，,调节,连苯三酚溶液用量，将其自氧化速率控制在,0.070,（,0.002,）,D/min,。经实验测得连苯三酚溶液的用量为,61,。,（,2,）样品活性测定,在,10ml,试管中加入,pH,为,8.30,的,4.5ml50mmol/L K2HPO4-KH2PO4,缓冲溶液和一定体积的样液，在,250.5,的恒温水浴中保温,10min,，然后加入,在,250.5,的恒温水浴中事先预热好的连苯三酚,61,，（空白管用,10mmol/L HCL,代替），迅速摇匀倒入,1cm,比色皿中，以空白管为参比，在,325nm,下，每隔,30s,测,1,次吸光值，连续记录,3min,，调节样液体积，使样液中连苯三酚的氧化速度控制在,0.035,（,0.002,）,D/min,，记录此时样液体积。,五.,SOD,使用及生产时的注意事项,1.SOD,的安全性,大量试验和临床应用表明，无论何种给药方式，除罕见的超敏反应外，,SOD,对人体无毒性。虽然,SOD,是,Mr,在,30 000,以上的蛋白质，但却未发现具有抗原性，其原因也正在进一步研究中。,2.SOD,生产时的注意事项,（,1,）在,破碎细胞时要注意安全，一定要破碎的彻底,（,2,）,PH,的控制力度很重要，以及在实验中的温度等,（,3,）,要学会正确使用,分光光度计,紫外分光光度法测定蛋白质含量,本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于,280 nm,附近（不同的蛋白质吸收波长略有差别）。在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度的关系服从朗伯,-,比耳定律。该测定法具有简单灵敏快速高选择性，且稳定性好，干扰易消除不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定等优点。,谢谢观看,