实验4肝糖原的提取鉴定与定量.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,肝糖原的提取、鉴定与定量,1,实验目的,1.,掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。,2.,了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。,3.,正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。,4.,熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合适的混匀方法）。,5.,正确掌握溶液转移的操作。,6.,正确操作使用分光光度计。,2,实验原理,（一）肝糖原的提取、鉴定,糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用,95,乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。,3,实验原理,（二）肝糖原的鉴定,糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。,CuSO,4,+2NaOH Na,2,SO,4,+Cu(OH),2,2Cu(OH),2,+C,6,H,12,O,6,2CuOH+,氧化型葡萄糖,+H,2,O,2CuOH Cu,2,O(,红色,)+H,2,O,Cu(OH)2,CuO(,黑色,)+H,2,O,4,（三）肝糖原的定量,糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物,5-,羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在,620nm,处有最大吸收。糖含量在,(10100)mg,范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法（直接比较法）即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其它成分，而保留肝糖原。,实验原理,5,实验材料,（一）仪器,1.,普通离心机，室温,100,恒温水浴箱（,2,），722,型分光光度计，精度为,10mg,级电子天平（,1,）,2.,剪刀（,1,），镊子（,1,），研钵（,1,）,3.,试管架（,1,），,10mL,离心管（,2,），（,10015,）,mm,试管（,6,）,4.,刻度吸量管（,2mL1,，,5 mL2,），,1000L,微量可调取液器（,1,）,5.100mL,容量瓶（,1,）,6.,白瓷反应板（,1,）,6,实验材料,（二）试剂,1.,鸡肝。,2.95,乙醇。,3.0.31mol/L(5,),三氯醋酸溶液：称取未潮解的三氯醋酸（,C2HCl3O2,，,163.39,）,5g,，加蒸馏水溶解至,100 mL,。,4.0.15mol/L NaCl,溶液：称取,8.8g NaCl,加蒸馏水溶解至,1000 mL,。,5.12mol/L HCl,：浓,HCl,原液（,36%38%,）。,6.12.5mol/L(50,)NaOH,：称取,NaOH 50g,，用蒸馏水溶解至,100mL,。,7.,碘试剂：碘,l00mg,和,K1 200mg,溶于,50mL,蒸馏水中。,7,实验材料,8.,班氏试剂：称取柠檬酸钠（,C5H5Na3O75H2O,，,294.10,）,17.3g,和无水碳酸钠（,Na2C03,，,105.99,）,100g,溶于蒸馏水,700mL,中，加热促溶。冷却，慢慢倾人,17.3,硫酸铜（,CuSO45H2O,，,249.68,）,l00mL,，边加边摇。再加蒸馏水至,1000mL,，混匀，如混浊可过滤取滤液。此试剂可长期保存。,9.5.35mol/L(30,)KOH,溶液：称取,KOH 30g,，加蒸馏水溶解至,100 mL,。,11.,标准葡萄糖液,(50mg/L),：称取已干燥恒重的无水葡萄糖,25mg,，加蒸馏水溶解至,500 mL,。,12.17mol/L(90,)H2SO4,：量取蒸馏水,30mL,，加浓,H2SO4500 mL,。,13.,蒽酮显色剂：称取蒽酮,0.20g,，用,17mol/L H2SO4,溶解至,100 mL,。此试剂不稳定，以当日配制为宜，冰箱保存可用,45,天。,8,操作步骤,（一）肝糖原的提取,9,操作步骤,10,注意事项,1,肝糖原提取一步，向上清液中加人等量的,95,乙醇后，务必注意混匀。由于上清液为水溶液，比重大于,95,乙醇，溶液分成两层。加之上清液已,4mL,多，加上等量乙醇，总量接近,9mL,，混匀操作比较困难，最好用倾倒混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。,2,糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。葡萄糖残基在,20,个以下的会使碘呈现红色，,20,30,个之间使碘呈现紫色，,60,个以上的会使碘呈现蓝色。淀粉中分枝链较长，故呈蓝色，而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在,20,个以下（通常,8,12,个葡萄糖残基），吸附碘后呈现红棕色。,3,糖原水解液中葡萄糖的鉴定一步，加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑色浑浊，观察不到应有的结果。,操作步骤,11,（二）肝糖原定量测定,操作步骤,12,操作步骤,13,