实验二：ERIC-PCR指纹图谱技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,实验二,ERIC-PCR指纹图谱技术 在分子生态学中的应用,.,实 验 目 的,明确ERIC-PCR技术用于分析微生物群落结构的原理。,掌握ERIC-PCR的操作方法。,.,ERIC(,E,nterobacterial,R,epetitive,I,ntergenic,C,onsensus)-PCR,Hulton,1991,首次在肠道细菌基因组中发现ERIC序列,Versalovic,1991,发明ERIC-PCR，,对细菌的基因组DNA进行指纹图分析,Gillings,1997b,ERIC-PCR可以从植物、动物、真菌等的基因组DNA中扩增出稳定的、多态性丰富的图谱,。,Gillings,1997a,ERIC-PCR不只针对ERIC序列，实际上是一种“长引物随机PCR(LP-RAPD)”,Di Giovanni,1999,用ERIC-PCR分析混合菌群的组成,高平平,2003,Wei,2004,将ERIC-PCR方法引入复杂环境微生物群落的研究,.,ERIC-PCR是一种长引物随机PCR技术,普通RAPD,LP-RAPD,引物常为,8-10bp的单个引物,单个或一对长度大于16bp的引物,退火温度低于40,退火温度高于52,图谱稳定、重复性高，对底物的序列差异敏感性高，产生的图谱多态性丰富,PCR反应的一般原理,PCR:,聚合酶链式反应，即通过引物延伸核酸的某个区域而进行的重复双向,DNA,合成。,基本要素：,DNA,模板,一对寡聚,DNA,引物（启动,DNA,扩增）,Taq,DNA,聚合酶（催化,DNA,合成）,缓冲液（提供,DNA,合成所需,pH,、离子强度等环境）,dNTP,（,DNA,合成的原料）,PCR原理,.,ERIC-PCR程序,95,7min,94,1min(变性),52,1min(退火)30 cycles,68,8min(延伸),65,16min,.,实 验 材 料,1.试剂,无菌水,25,mmol,/L MgCl,2,溶液,10,扩增缓冲液,:,含,500mM,KCl,100,mM,Tris-HCl,(PH9.0),1%TritionX-100,2.5,mmol,/L,dNTP,混合液,20pmol/l,引物,E1,20pmol/l,引物,E2,5 U/,l,Taq,DNA,聚合酶,DNA,模板（,40-80ng,环境样品总,DNA,）,.,2.仪器设备,.,实 验 步 骤,制备,PCR mixture(25,l,system),无菌水,13,l,10 buffer,2.5,l,25,mmol/l,MgCl,2,溶液,2.0,l,2.5,mmol,/L,dNTP,混合液,2.0,l,20pmol/L,引物,E1,0.5,l,20pmol/L,引物,E2,0.5,l,加入模板,DNA,（,40ng,）,4.0,l,20.5,l,24.5,l,NC 样品 PC,.,放入,PCR,扩增仪，,95,变性,7min,取出,PCR,小管，迅速加入,0.5l,Taq,DNA,聚合酶,，混匀，简短离心。（后加酶可保证模板变性完全且不损坏,Taq,DNA,聚合酶的活性）,5.,放入PCR扩增仪，按以下程序进行扩增：,94 1 min，52 1 min,65 8 min，共30个循环；,65延伸16min，1个循环。,.,程序结束（约,6.5h),取出,PCR,小管,吸取,2l,扩增产物用浓度仪测定浓度,8.,400ng PCR产物电泳,9.凝胶成像，保存图谱,.,Mr NC S PC,结果：,.,注 意 事 项,避免污染,PCR体系中所有试剂必须保证无其它杂菌DNA的污染。,制备PCR混合物的操作应在超净台上进行。,打开PCR扩增小管时切勿用手指接触管盖内侧。,用移液器吸取试剂时要轻吸轻放。,定量,模板DNA的量一致,电泳时PCR产物上样量一致,.,