实验室污染防治.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,.,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,.,*,PCR,污染的产生及防治,分子生物学技术平台讨论会,PCR,系列之一,2008-2-28,.,PCR,污染的监测,PCR强大扩增能力,+,检测的敏感性,经,30,个周期后，特定,DNA,片段的数量在理论上可增加,10,9,倍,极微量的污染便可导致假阳性，尤其对定量造成很大的问题,NTC,(No Template Control):,必须,设置一个不含模板,DNA,但含有,PCR,系统中所有其他成分的对照反应，这一对照管须在准备好所有其他,PCR,以后才进行吸加。,.,常见的,PCR contamination,常规,PCR,荧光定量,PCR,NTC,4,3,2,1,7,6,5,9,8,NTC,.,引起,PCR,污染的原因,模板间交叉污染,容器被污染,模板放置时,由于密封不严溢于容器外,容器外粘有模板而造成相互间交叉污染,模板吸取过程中,因气溶胶（,aerosol,）或其他原因引起移液器污染，从而导致交叉污染,.,引起,PCR,污染的原因,PCR,试剂污染,PCR,试剂配制过程中,移液器、容器、水等原因造成试剂被,PCR,核酸模板污染。,.,引起,PCR,污染的原因,PCR,产物污染,-,最主要最常见,PCR,产物拷贝量大，极微量的,PCR,产物污染,就可形成假阳性。,移液器吸取,PCR,产物进行电泳检测，同一支移液器去准备,PCR mix,PCR,产物的气溶胶污染：,一个气溶胶颗粒可能含几万个拷贝,气溶胶（,aerosol,）：悬浮于气体介质中粒径一般为,0.001m1000m,的固体、液体微小粒子形成的胶溶状态散体系。空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及移液器的反复吸样都可形成气溶胶,.,引起,PCR,污染的原因,实验室中克隆质粒的污染,克隆质粒浓度高,另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂,其污染可能性也很大,.,防止,PCR,污染,首要原则,永远要设置,NTC,对照,如果不能在污染出现的第一时间发现，会导致严重的后果：一大段时间的数据不可信,准备,PCR,的移液器要专用,千万不能,用吸取,PCR,产物,/,克隆质粒的移液器去准备,PCR,体系,.,防止,PCR,污染,空间：,合理分隔实验区域,:,将样品的处理、配制,PCR,反应液、,PCR,循环扩增及,PCR,产物的鉴定等步骤分区进行，特别注意样本处理及,PCR,产物的鉴定应与其它步骤严格分开。,理想状态：,各个区域实验用品及移液器专用，实验前应将该区域用紫外线消毒，破坏残留的,DNA,或,RNA,。,.,防止,PCR,污染,操作,一旦进入吸加,PCR,试剂的专用场所并开始工作，就应戴上一副新手套，并应勤于更换。,准备专供自己使用的,PCR,试剂，分装为小份。不要与样品存放在一起。,选择质量好的,Eppendorf,管,-,密封性好且开管不需要太大力气,打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。,实验结束后及时清理台面,.,防止,PCR,污染,移液器操作,由于操作时不慎将模板吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样时要十分小心。,1,）准备,PCR,的移液器专用,2,）吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，切勿形成喷雾，以免交叉污染或产生气溶胶污染。,3,）最好在加完所有其他反应成分后才吸加模板。,4,）推荐在准备,PCR,过程中使用滤芯枪头,.,选用含,UNG,（尿嘧啶,DNA,糖基酶,Uracil-N-Glycosylase),的试剂，有助于防止,PCR,产物引起的污染。,UNG,：,50,摄氏度，,2,分钟，作用于含有,dU,的,DNA,双链或单链,然后开始,PCR,反应的预变性步骤，同时,UNG,失活防止,PCR,污染,对于不含,dU,的,PCR,产物无效,.,出现污染后解决办法,更换试剂,更换新的试剂和水，用确保无污染的移液器分装备用,清洁所有可能的污染源：实验台面、小离心机、冰箱门把手等等,1,）实验台面、超净工作台用现配的,3%,双氧水或,10%,次氯酸钠溶液擦拭清洁。,2,）或者用,10%,漂白粉溶液擦拭,3),紫外光照射，照射距离应不超过,90 cm,，照射时间最好过夜。,实验过程中更加小心，采用前面提到的各种防止污染的办法,.,参考文献,Kwok S,Higuchi R.Avoiding false positives with PCRJ .,Nature,1989,339(6221):237-238.,Mifflin T.E.Setting Up a PCR Laboratory.,CSH Protocols;2007;doi:10.1101/pdb.top14,.,讨论,设置,-RT,对照后是不是可以不用设,NTC,了？,使用了滤芯枪头，是否不需要移液器专用了？,.,