免疫荧光试剂盒临床应用.ppt

免疫荧光试剂盒在生殖道感染病原体检测中的临床应用,免疫荧光技术,免疫荧光标记技术（,immunofluorescence,technique,）是标记免疫技术的一种，是在免疫学、生物化学和显微镜技术基础上建立起来的一项技术。,经过不断改进发展，免疫荧光技术已成为微生物学、免疫学、病理学及免疫组织化学中,准确,又,快速,的一种免疫学实验方法。,1,免疫荧光原理,将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与样本中的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。,基本反应原理为抗原,抗体间的反应,2,免疫荧光特点,特异性强、敏感性高、检测速度快,（单个样本处理时间约,40,分钟，批量样本报告时间以半天或隔天最佳）,直接免疫荧光法（,DFA,）,将标记的特异荧光抗体直接加在抗原标本上，经一定温度和时间的染色，在荧光显微镜下便可观察到被检抗原与荧光抗体形成的特异性结合物所发出的荧光,。,直接免疫荧光示意图,免疫荧光技术的应用,免疫荧光技术应用范围极其广泛，可以应用于生物学的各个领域。,尤其适用病原微生物的快速鉴定检测，具有,形态学,和,免疫学,的双重优点。,临床实验室改进组织,(CLIA),指出直接免疫荧光法最适合用于日常临床和参考实验室检测。,迈科龙免疫荧光法生殖道病原体,检测试剂盒,免疫荧光试剂盒,注册证号,适用范围,沙眼衣原体,C.T.,国食药监械（准）字,2010,第,3401154,号,宫颈感染、尿路感染、产前筛查、不孕不育,奈瑟氏淋球菌,N.G.,国食药监械（准）字,2010,第,3401157,号,宫颈感染、尿路感染、产前筛查、不孕不育,阴道加德纳菌,G.V.,国食药监械（准）字,2010,第,3401155,号,BV,、复发性,BV,、产前筛查、不孕不育,白色念珠菌,C.A.,国食药监械（准）字,2010,第,3401153,号,霉菌性阴道病,单纯疱疹病毒,II,型,HSV-II,国食药监械（准）字,2010,第,3401156,号,生殖器疱疹,阴道毛滴虫,T.V.,国食药监械（准）字,2010,第,3401158,号,滴虫性阴道病,造成非淋菌性尿道炎的重要病原体，其感染已超过淋球菌感染而位居性传播疾病之首,可致尿道炎、宫颈炎、子宫内膜炎及盆腔炎,对怀孕可致早产、流产、胎膜早破、胚胎停育等严重妊娠并发症,产道感染可致婴儿急性结膜炎,母婴传播可致新生儿眼炎或肺炎,引起不孕不育,沙眼衣原体,1.,临床意义,潜伏期,，,平均为,1,3,周,男性,患者临床,表现,：,尿痛,，或尿频、尿道刺痒和不适，阴体局部疼痛,尿道分泌物常为浆液性或粘液脓性，较稀薄，量少,女,性,患者临床,表现,：,尿道有分泌物，呈浆液性或浆液脓性，尿痛，尿频,白带增多，色黄或带血性，或有异味,非经期或性交后出血,宫颈品可见粘液脓性分泌物，宫颈充血、消肿，触之易出血2.,临床表现,近年来国际上已将免疫荧光法作为一项“扩大的金标准”来鉴定沙眼衣原体培养和非培养结果相异的标本，其敏感性为,80%-90%,，特异性则在,95%,以上。,卫生部颁布的,非淋菌性尿道炎诊断标准及处理原则,（,WS238,2003,）中，直接免疫荧光法为沙眼衣原体推荐检测方法。,沙眼衣原体临床检验方法,临床检验方法,灵敏性（,%,）,特异性（,%,）,优缺点,胶体金法,52.78,差,98.86,方法简便、快捷，适于短时内大批量标本的测定，特异性低，灵敏度不高，易造成假阴性，阳性检出率,5%,，临床实际检出率多仅,1-2%,漏检率太高，不适用于妇产等低感染人群筛查,免疫荧光法,9272,97.89,操作简便，检测时间短，可检出标本中存在的原体和包涵体。具有专一性好、特异性强、灵敏度高等特点，在衣原体感染早期就可被发现，对衣原体感染的早期诊断具有特殊意义。,沙眼衣原体检测,“,金标准,”,沙眼衣原体阳性图片,治疗方案,初发病例,多西环素,100mg,，口服，,2,次,/,日，连服,7,10,天,阿奇霉素,1g,，一次顿服，饭前,1,小时或饭后,2,小时服用,红霉素,500mg,，口服，,4,次,/,日，连服,7,天,琥乙红霉素,800mg,，口服，,4,次,/,日，连服,7,天,氧氟沙星,300mg,，口服，,2,次,/,日，连服,7,天,米诺环素,100mg,，口服，2,次,/,日,，,连服,10,天,复发性或持续性病例,，,尚无有效的治疗方案，推荐方案为,：,甲硝唑,2g,单次口服，加红霉素碱,500mg,，口服，,4,次,/,日，共,7,天,琥乙红霉素,800mg,，口服，,4,次,/,日，连服,7,天,孕妇禁用多西环素和氧氟沙星，推荐方案为：,红霉素,500mg,，口服，,4,次,/,日，共,7,天,红霉素,250mg,，口服，,4,次,/,日，共,14,天,琥乙红霉素,800mg,，口服，,4,次,/,日，共,7,天,阿奇霉素,1g,，一次顿服,造成细菌性阴道炎的主要病原体，在阴道分泌物中检出阴道加德纳菌可用于诊断细菌性阴道炎,引起尿道炎和阴道炎导致早产、低体重儿、绒毛膜炎、羊膜炎、羊水感染、子宫内膜炎、急性输卵管炎、手术后感染和子宫颈癌等,经性接触传播，与男性非淋菌性尿道炎有一定关系,影响精子质量，是男性不育的重要原因之一,妊娠期感染，可能导致自然流产、早产,产前、孕早期上行感染可致胚胎停止发育,阴道加德纳菌,1.,临床意义,2.,临床表现：,阴道分泌物呈灰白色，很粘稠，甚至象面糊状，均匀一致，但不是脓性分泌物，量多少不定。,分泌物中胺含量特别高，故呈鱼腥味，性交时或活动后往往因促进胺释放而使气味加重，分泌物中加入,10%,氢氧化钾后也可释出胺味。,3.,临床检验方法,临床检验方法,灵敏性（,%,）,特异性（,%,）,优缺点,快速BV,试验,75,88,95,敏感性高、但其他细菌、滴虫等都能对检测产生干扰，导致假阳性。,代谢产物，间接指标，重复性差,革兰染色,47.37,94.7,75,98,简便、快速；背景复杂、易漏检，需要实验者具备丰富的实践经验寻找足够数量的线索细胞,不具备特异性,阴道加德纳菌,免疫荧光法,94.53,97.51,操作简便，检测时间短，可直接检测出主要致病菌，标本需要量少、特异性强、结果判断直观、灵敏度高等优点,直接检测病原微生物，检测意义清晰,阴道加德纳菌阳性图片,治疗方案,非孕期,推荐方案,甲硝唑,500 mg,，口服，,2,次,/d,，共,7d,0.75%,甲硝唑膏,(5g),，阴道上药，2,次,/d,，共,5d,2%,克林霉素膏,(5g),，阴道上药，,1,次,/,晚，共,7d,替代方案,克林霉素,300mg,，口服，,2,次,/d,共,7d,克林霉素栓,300g,阴道上药，,1,次,/,晚，共,3d,妊娠期,甲硝唑,500mg,，口服，,2,次,/d,，共,7d,甲硝唑,250mg,，口服，,3,次,/d,，共,7d,氯洁霉素,300mg,，口服，,2,次,/d,，共,7d,哺乳期,选择局部用药，尽量避免全身用药,奈瑟氏淋球菌,造成淋病的病原微生物，引发以泌尿生殖道化脓性炎症为主要临床症状的性传播疾病,淋病是常见的性传播疾病之一，且发病率呈上升趋势，已构成威胁公众健康的重大疾病,妊娠期感染淋病对母婴危害极大，宫内感染易致自然流产、早产及胎儿宫内发育迟缓,分娩时母婴垂直传播，可致新生儿淋病性结膜炎，治疗若不及时彻底，新生儿有致盲的危险,淋病孕妇产后易发生散播性淋病,1.,临床意义,2.,临床表现,:,2.1,无合并症淋病,2.1.1,男性淋菌性尿道炎,尿道口红肿、发痒、有稀薄或黏液脓性分泌物,，,尿痛、烧灼感，排出黏稠的深黄色脓液。,2.1.2,女性泌尿生殖系统的淋病,淋菌性尿道炎,：,尿频、尿急、尿痛、尿血及烧灼感。尿道口充血发红，有脓性分泌物；,淋菌性宫颈炎,：,为女性淋病的主要表现，白带增多、阴道口有黏液脓性分泌物排出，外阴瘙痒，阴道内轻微疼痛和烧灼感,，阴道口充血，水肿，子宫颈口充血，糜烂，有黏液脓性分泌物。,女童淋病,：,可见阴道口、尿道口、会阴部红肿，病变部位可出现糜烂、溃疡和疼痛。阴道有脓性分泌物，排尿困难。,2.2,有合并症淋病,2.2.1,男性淋病合并症,淋菌性附睾炎、睾丸炎,：,阴囊或睾丸有牵引痛，进行性加重，且向腹股沟处扩散，体温可升高至,4O,。检查可见附睾、睾丸肿大、压痛，病情严重时可触及肿大的精索及腹股沟淋巴结,淋菌性前列腺炎,：,发热、尿痛、尿频、尿急，有排尿不尽感和会阴胀痛，前列腺肛检有明显压痛和肿大,其它合并症,：,可并发尿道旁腺炎、尿道周围脓肿、海绵体炎、淋菌性龟头炎或龟头包皮炎、尿道狭窄等,2.2.2,女性淋病合并症,淋菌性盆腔炎,:,包括淋球菌性子宫内膜炎、输卵管炎、输卵管卵巢脓肿、腹膜炎等,，,好发于育龄妇女,。,多数病人有白带增多，且为脓性或血性,。,双下腹痛,，伴有,畏寒、发热、头痛、厌食、恶心、呕吐,等,淋菌性前庭大腺炎,：,出现前庭大腺红肿、疼痛，腺体开口处有脓性分泌物，大阴,唇,下,1/2,肿胀明显，还可伴有全身症状和腹股沟淋巴结肿大。,3.,临床检验方法,临床检验方法,灵敏性（,%,）,特异性（,%,）,优缺点,革兰染色法,男性：,95%,；女性：,75%,/,操作简便，对男性急性样本准确率较高。对于慢性样本及女性样本，由于杂菌较多，背景复杂，易漏检。,不适用女性患者，尤其是慢性女性患者,培养法,85,95,100,受标本的采集、运输、保存以及病人的病情等因素影响较大，测定所需时间较长，不利于快速诊断与及时治疗，并且易受抗生素影响，出现假阴性。,阳性检出率偏低，报告时间长,免疫荧光法,93.28,98.17,操作简便，检测时间短，不受标本的运输、保存及菌体活力影响，灵敏度高、特异性强，适用于临床各期患者。,快速、准确、操作简单,卫生部,淋病诊断标准,（,WS268-2007,）指出，免疫荧光法可用于奈瑟氏淋球菌培养样本鉴定。,奈瑟氏淋球菌阳性图片,治疗方案,推荐方案,头孢曲松,125mg,，单次肌注,头孢克肟,400mg,，单次顿服,环丙沙星,500mg,，单次顿服,氧氟沙星,400mg,，,单次顿服,左氧氟沙星,250mg,，单次顿服,白色念珠菌,阴道正常菌群之一，在各种致病因素影响之下，念珠菌优势繁殖引起外阴阴道念珠菌病,(VVC),VVC,是仅次于细菌性阴道病的阴道感染性疾病，,75%,的育龄妇女一生至少有一次发病,白色念珠菌是阴道感染念珠菌的主要病原体，占,80%-90%,孕期感染未治疗或治疗不彻底可能因产时阴道操作引起产道感染，导致子宫复旧不良或伤口感染等,妊娠合并念珠菌性阴道病患者的胎儿多数在通过产道后感染，新生儿心、肺、脑组织等均存在念珠菌病灶,1.,临床意义,包括女性阴道炎及龟头包皮炎。,阴道炎：阴道分泌物粘稠、色黄或奶酪样斑片，在阴道壁上可见灰白色假膜样斑片，有瘙痒或灼热感。,龟头包皮炎：较少见，可见包皮及龟头潮红、干燥光滑，包皮内侧及冠状沟可见覆有假膜的斑片。,2.,临床表现,：,白色念珠菌临床检验方法,临床检验方法,灵敏性（,%,）,特异性（,%,）,优缺点,湿片法,75,检出率偏低，其检出率为,30%-50%,，背景复杂、易漏检,革兰染色,88,95,背景复杂、易漏检,免疫荧光法,94.1,97.23,操作简便，检测时间短，灵敏度高、特异性强，不易受样本中杂菌的影响。,白色念珠菌阳性图片,治疗方案,可选择下列药物放于阴道内：,咪康唑栓剂，每晚,1,粒,(200mg),，连用,7,天；或每晚,1,粒,(400mg),，连用,3天,克霉唑栓剂，每晚,1,粒,(150mg),，塞入阴道深部，连用,7,天，或每天早、晚各,1,粒,(150mg),，连用,3,天；或,1,粒,(500mg),，单次用药,娇妍凝胶消毒剂，每晚一次，连用,10,14,天,也可选择口服药物：,氟康唑,150mg,，顿服,伊曲康唑每次,200mg,，,1,次,/d,，连用,3,5,天；或口服,400mg,，,1,天,服用,2,次,单纯疱疹病毒,II,型,生殖器溃疡最常见的原因之一，引起生殖器疱疹,侵犯生殖器皮肤、粘膜引起红斑、水痘、糜烂及溃疡性损害,生殖器感染与宫颈癌有关,增高对人类免疫缺陷病毒（,HIV,）的易感性,生殖器溃疡促进,HIV,异性间传播,生殖器感染具有反复发作性,早期诊断和治疗对促进患者皮损愈合，降低其传染性及危害性有重要意义,1.,临床意义,原发性生殖器疱疹,外生殖器或肛门周围有群簇或散在的小水疱，,24,天后破溃形成糜烂或溃疡，自觉疼痛,腹股沟淋巴结常肿大，有压痛,常,伴,有发热、头痛、乏力等全身症状,复发性生殖器疱疹,起疹前局部有烧灼感，针刺感或感觉异常,外生殖器或肛门周围群簇小水疱，很快破溃形成糜烂或浅溃疡，自觉症状较轻。,2.,临床表现,3.,临床检验方法,临床检验方法,灵敏性（,%,）,特异性（,%,）,优缺点,PCR,法,94,100,95.7,检测,HSV DNA,，,实验条件要求高，,多在专科医院,应用,，难以普及推广,免疫荧光法,95.2,97.59,操作简便，检测时间短，不受皮疹部位及其病毒量影响，灵敏度高、特异性强,开展方便,单纯疱疹病毒,II,型阳性图片,治疗方案,生殖器疱疹首次发作,推荐方案,无环鸟苷,400mg,，,3,次,/d,，口服，,710d,无环鸟苷,200mg,，,5,次,/d,，口服，,710d,泛昔洛韦,250mg,，,3,次,/d,，口服，,710d,伐昔洛韦,1g,，,2,次,/d,，口服，,710d,如果未完全治愈,治疗疗程可超过,10 d,间歇治疗：即发作时给予抗病毒药物，推荐在出现前驱症状或皮损出现,24h,内开始用药，可选择的方案包括,：,口服阿昔洛韦200mg,每日,5,次，共,5,天,阿昔洛韦,400mg,每日,3,次，共,5,天,伐昔洛韦,500mg,每日,2,次，共,5,天,伐昔洛韦,300mg,每日,2,次，共,7,天,泛昔洛韦,250mg,每日,3,次共,5,天,对于初发性生殖器疱疹，剂量不变，疗程延长至,10,天,长期抑制治疗：对于发作频繁的患者，可推荐长期抑制疗法,，,可选择的方案包括,：,阿昔洛韦,400mg,，口服,2,次,/d,泛昔洛韦,250mg,，口服,2,次,/d,伐昔洛韦,500mg,，,口服,1,次,/d,伐昔洛韦,1.0g,，口服,1,次,/d,特殊人群的治疗：,新生儿疱疹：,早,期静脉给子抗病毒治疗，如阿昔洛韦（每次,5mg/kg,）每,8,小时,l,次,，,症状控制后，可考虑口服治疗维持,。,妊娠疱疹：初发,者,，口服阿昔洛韦,400mg,每天,3,次，有严重并发症者应静脉滴注阿昔洛韦。频繁复发或新近感染的孕妇，可在妊娠最后,4,周给予连续口服阿昔洛韦,。,合并,HIV,感染者：与普通人群感染治疗策略相同,，,对发作次数频繁者更主张长期抑制疗法，但应关注耐药性。,试剂盒选择,国家规定临床检验室必须使用有注册证的产品，并定期进行试剂盒有效性检测,试剂盒评价,根据该试剂临床试验报告，了解其质量水平；,询问试剂的组成，如原料来源等判断试剂的优劣；,参考室间质评的评价结果，了解试剂的质控成绩；,根据权威部门发布的评价结果，了解试剂的质量优劣。,标本的采集和保存,临床医生应遵循样本采集原则，采集足够的样本量以反应其真实的样本信息。,采样过程中应避免血液污染样本，以免与血清中的抗体结合而导致假阴性结果。,取样后如不能及时涂片，样本需放入,28,冰箱保存。,1,涂片,将样本轻缓涂抹在载玻片上，晾干；,避免反复涂抹拭子,2,固定,使用固定剂固定,5,到,10,分钟，自然晾干；,常用固定剂：甲醇、丙酮或无水乙醇,操作流程,3,加样,用微量移液器吸取一定量试剂均匀滴加在玻片涂样处，避免产生气泡；,每次加样应更换吸嘴，做到一份样本一吸头，避免发生交叉污染。,4,孵育,置于,37,水浴锅孵育，孵育时间,20,到,30,分钟。,避免试剂在玻片上干燥，否则将加重非特异性染色，且有可能造成假阳性结果。,5,洗涤,使用纯净水缓缓冲洗玻片多次，每次,5,秒钟，自然晾干。,注意：勿用水流直接冲洗涂样处。,6,观察,滴加无荧光镜油后于,100X,荧光显微镜下观察；,观察尽可能多的视野，以充分反应样本信息。,注意：黄色荧光为非特异性染色或自发荧光。,试剂盒使用注意事项,试剂盒应避光冷藏；,试剂盒在使用前应恢复至室温；,在有效期内使用。,不同批号试剂请勿混用。,勿使用已变色或者产生絮状沉淀的试剂。,勿随意丢弃污染性废物。,谢 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