抗生素发酵工程.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,抗生素发酵工程,1,第一节 抗生素,概,论,一、抗生素的定义,传统的定义：,抗生素（,antibiotic,）,是微生物细胞产生的能以低浓度抑制其他微生物细胞生长的化学物质。,现代定义：,抗生素是生物细胞产生的能以低浓度抑制其他生物细胞生长或功能的化学物质,抗生素与药理活性物质的区别：,药理活性物质,作用于动植物体本身的生理功能（如免疫调节、降血脂、降血糖、降血压、抗炎、减肥、动植物生长促进、植物生长抑制等等）,抗生素,作用于动植物体内的寄生（或赘生）生物（细菌、真菌、病毒、癌细胞等）,2,据世界卫生组织,WHO)1999,年统计，全世界每年有,1400,万人死于感染病，占死亡人数的第一位，其次是心脏病、癌症和脑疾病，分别为,750,万人、,700,万人和,550,万人。,一种新的抗生素研制的费用大约需要十几亿美金和,10,到,15,年的过程，而使用不当，,3,到,5,年病菌就会对这种药物产生耐药性。,我国的金黄色葡萄球菌的耐青霉素比例已经高达,90%,，造成肺炎的病菌在社区的标本有,20%,可以耐药，而在医院内这一比例可以达到,60%,。肺炎链球菌已有,45%,耐青霉素，,70%,耐红霉素。,3,二、青霉素的发现者及,1945,年诺贝尔生理学医学奖获得者,Alexander Fleming(1881-1955),B.,Chain(1906-1979),W.,Florey(1898-1968),返回,4,三、微生物产生抗生素,1,、放线菌产生的抗生素：,链霉菌属,：放线菌素、链霉素等,60,种类。,小单抱菌属,：红霉素（大环内酯类）、新霉素（氨基环醇类）,诺卡氏菌属,：肌霉素（氨基环醇类）、诺卡氏菌素,5,2,、细菌产生抗生素,芽孢杆菌属：,多粘芽孢杆菌和,枯草芽孢杆菌,假单胞菌属：,铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）,杆菌肽、粘杆菌素、多黏菌素等多肽类。,3,、真菌产生抗生素,青霉属：,青霉素、灰黄霉素。,头孢菌属：,头孢霉素,6,四、抗生素的分类（一）,类,亚类,主要品种,b,-,内酰胺类,(,b,-Lactams,),青霉素类,头孢烯类,氧头孢烯类,碳头孢烯类,青霉烯类,碳青霉烯类,单环内酰胺类,-,内酰胺酶抑制剂,青霉素,G,，,青霉素,V,，,氨苄西林，阿莫西林，,头孢噻吩，头孢唑啉，头孢氨苄，头孢羟氨苄，,拉氧头孢，氟氧头孢,氯碳头孢,瑞替配能，法罗配能,亚胺配能，帕尼配能，美洛配能，比阿配能,氨曲喃，卡鲁莫喃,棒酸，舒巴坦，三唑巴坦，舒他西林，三唑配能,7,H,N,O,N,S,CH,3,CH,3,H,COO-,H,-,lactam,ring,-,内酰胺环,R,8,抗生素的分类（二）,类,亚类,主要品种,氨基糖苷类,(Amino-glycosides),天,然,半合成链霉素，卡那霉素，庆大米星,(,庆大霉素,),，小诺米星,(,小诺霉素,),，核糖霉素，妥布霉素，紫苏霉素，阿斯米星,(,福提霉素,),，大观霉素，新霉素，春日霉素，有效霉素,半合成卡那霉素：阿贝卡星，阿米卡星，地贝卡星；半合成紫苏霉素：奈替米星；半合成庆大霉素：衣替米星,9,抗生素的分类（三）,类,亚类,主要品种,大环内酯类,(Macro-lactones),14,员环,15,员环,16,员环,20,员,红霉素,，竹桃霉素，半合成红霉素克拉霉素、罗红霉素、地红霉素、氟红霉素,阿齐霉素,(,半合成红霉素,),柱晶白霉素,(,北里霉素,),，交沙霉素，麦迪霉素，罗他霉素,(,丙酰柱晶白霉素,)乙酰,螺旋霉素,和丙酰螺旋霉素,(,半合成螺旋霉素,),，三冈霉素,(,半合成麦迪霉素,),，泰洛菌素，除虫菌素，双氢除虫菌素,(,半合成除虫菌素,),，环氧噻酮,藤霉素,(,他克莫司,),，雷帕霉素,(,昔洛莫司,),10,红霉素,A,克拉霉素 罗红霉素 氟红霉素,R,1,H,CH,3,H,H,R,2,O,O,NOCH,2,O(CH,2,),2,OCH,3,O,R,3,H,H,H,F,11,抗生素的分类（四）,类,亚类,主要品种,四环素类,(Tetra-,cyclines,),天然,半合成,四环素，土霉素，金霉素，,去甲基金霉素,脱氧土霉素,(,多西环素,),，甲烯土霉素,(,米他环素,),，二甲胺四环素,(,米诺环素,),多肽类,(peptides),杆菌肽，短杆菌肽,S,，,多粘菌素,B,，,粘杆菌素，卷曲霉素，结核放线菌素，丝裂霉素，环孢素,(,环孢菌素,),，古斯莫司，乌苯美司，二丙膦,12,作用机制（一）,作用机制,抗生素,主要作用靶位,抑制细菌细胞壁肽聚糖生物合成,-,内酰胺类磷霉素,糖肽类,环丝氨酸,杆菌肽,抑制转肽酶活性，破坏肽聚糖相互交联,和肽聚糖生物合成中的,UDP-,N,-,乙酰葡糖胺丙酮酰转移酶结合，阻断,UDP-,N,-,乙酰葡糖胺向,UDP-,N,-,乙酰胞壁酸的转化,与,D-,丙氨酰,-D-,丙氨酸结合，抑制转糖基和转肽反应,抑制丙氨酸消旋酶和,D-,丙氨酰,-D-,丙氨酸合成酶,抑制焦磷酸酶，阻断肽聚糖跨膜载体十一聚异戊二烯醇再生,13,作用机制（二）,作用机制,抗生素,主要作用靶位,破坏微生物细胞质膜功能,多烯类,唑类抗真菌药物,托萘酯,(,发癣退,),多粘菌素,B,粘杆菌素,短杆菌肽,S,脂肽类,(,Daptomycin,),与组成真菌细胞膜的麦角固醇结合而破坏膜功能,抑制真菌羊毛固醇脱甲基酶,(,细胞色素,P-450),，,阻断麦角固醇合成,抑制真菌角鲨烯单加氧酶,类似阳离子洗涤剂的作用，破坏细菌细胞膜的磷脂结构,切断细菌电子传递系统与氧化磷酸化的偶联,与,G(+),细菌的脂磷壁酸结合，使细胞质膜去极化，从而破坏膜的传输功能,14,作用机制（三）,作用机制,抗生素,主要作用靶位,抑制蛋白质生物合成,氨基糖苷类,四环素类,氯霉素、林肯霉素和大环内酯类,春日霉素,卷曲霉素,噁唑烷二酮类,与核糖体,30S,亚基和,50S,亚基结合，抑制肽酰,-,tRNA,转位,与,30S,亚基结合，抑制氨基脂酰基,-,tRNA,与,mRNA,密码子依赖性核糖体,A,位结合,作用于,50S,亚基中的,23S,核蛋白体,RNA(,rRNA,),，,抑制肽酰基转移酶,抑制,30S,亚基与甲酰蛋氨酸,-,tRNA,复合物的形成,与,30S,及,50S,亚基结合，抑制蛋白质合成的开始阶段和延长过程的转位,与,50S,亚基的,23S,rRNA,结合干扰,70S,功能起始复合物的形成,15,作用机制（四）,作用机制,抗生素,主要作用靶位,抑制,DNA,生物合成,磺胺类,甲氧苄啶,氨甲蝶呤,氨基蝶呤,丝裂霉素,C,博来霉素,萘啶酸，奎诺酮类，新生霉素,抑制细菌二氢叶酸合成酶,抑制细菌二氢叶酸还原酶,抑制,DNA,复制时的双链打开,与,DNA,结合，切断,DNA,的一条链,抑制细菌,DNA,促旋酶,(,拓扑异构酶,),抑制,RNA,生物合成,桑吉霉素，丰加霉素,放线菌素,D,蒽环类,利福霉素类,抑制转录反应,抑制,DNA,依赖性,RNA,聚合酶,抑制,DNA,依赖性,RNA,和,DNA,聚合酶,抑制细菌,DNA,依赖性,RNA,聚合酶,16作用机制（五）,作用机制,抗生素,主要作用靶位,作用于细胞内的阳离子,离子载体类抗生素,(,莫能菌素、盐霉素等聚醚类，二、三、四抗菌素等大环四内酯类，缬氨霉素、白僵菌素等肽类抗生素,),与细胞膜中的,Na,+,、,K,+,、,Ag,+,、,Ca,2+,等金属离子形成稳定的螯合物，影响细胞膜的离子透过性，打乱细胞内的离子分布，使细胞失去正常功能,抑制有丝分裂,灰黄霉素，长春花生物碱,与微管蛋白结合，干扰有丝分裂纺锤体的形成。,17,作用机制（六）,作用机制,抗生素,主要作用靶位,抑制能量代谢,抗霉素,A,，,杀稻瘟菌素,S,，,干蠕孢菌素,阻碍呼吸链的电子传递，抑制,ATP,合成酶,拮抗神经传递物质,除虫菌素，双氢除虫菌素,拮抗线形动物和节足动物的神经传递物质,-,氨基丁酸，使细胞神经麻痹，直至死亡,18,五、抗生素产生菌的选育,1,、抗生素产生菌的分离,2,、抗菌性试验,3,、抗生素产生菌的改良,(1),人工诱变,(2),原生质体融合,19,(3),体外,DNA,重组,克隆,20,六、抗生素的提纯,微生物在发酵过程中会产生多种代谢产物，包括各种初级代谢产物和次级代谢产物以及培养基的固有成分，这些成分的存在影响抗生素的使用效果，本身具有毒副作用，造成储存困难，必须经过精制。,21,抗生素提纯的基本步骤和原则,3,个基本步骤：,发酵液过滤和预处理、粗纯化、精制,4,个原则,：时间尽量短；采用适当较低浓度；条件适宜，,pH,适度，温度适宜；防止杂菌污染。,提取方法：,吸附、萃取、离子交换、沉淀,色谱分离、分子筛过滤、透析等等,22,第二节 青霉素的发酵工艺,23,1,、青霉素的产生菌,作为第一个具有临床应用价值的抗生素，,1928,年被发现，,1943,年在美国被首次实现工业生产。,点青霉的发酵单位很低,2U/mL,，目前国际上青霉素生产最高发酵单位,80000-90000U/mL.,生产菌种按其在深层培养中菌丝形态分为：,丝状菌和球状菌。,黄孢子丝状菌,绿孢子丝状菌,24,2,、青霉素的作用机制、抗菌谱及稳定性,(1),作用机制：,抑制细菌的转肽酶，阻止细胞壁合成中的交叉连接步骤，使处于繁殖分裂期的细菌细胞壁的合成发生障碍，导致菌体细胞壁损坏，使细胞内因渗透压等原因发生溶解而死亡。,(2),抗菌谱：作用于大多数革兰氏阳性细菌及部分革兰氏阴性细菌。,(3),稳定性：弱酸性的有机化合物，干燥纯净的青霉素盐很稳定，,pH5-7,，,6,最稳定。,25,5,、青霉素发酵工艺流程及发酵控制,青霉素发酵培养流程,26,(1),培养基的成分,组成和配比对菌体生长发育、发酵单位及质量,C,源：碳水化合物，葡萄糖、乳糖,N,源：玉米浆、黄豆粉；硝酸铵、氯化铵,无机盐：各种离子,前体物质：苯乙胺、苯乙酸,(2),发酵工艺控制：二级发酵，菌龄、特性、生长环境,(3),补料及控制：糖硫酸铵、苯乙酸、氨水、玉米油,(4),发酵温度、,pH,及通气搅拌的控制：温度：,26-27,，,pH:6.6-6.9,，通气搅拌：,1,：,0.95,27,(5),青霉素的提取,发酵液预处理萃取脱色反萃取过滤洗涤干燥,发酵液预处理：,A,加热使蛋白质变性沉淀；,B,加絮凝剂使蛋白质沉淀,C,固液分离离心,萃取工艺过程：二级逆流萃取,28,A,、萃取目的,：杂质多，含量少。,原理：,分配定律，青霉素,G,在水中溶解度小，易溶于醋酸丁酯、醇等有机溶剂中，青霉素盐易溶于水，不溶于有机溶剂。,青霉素在滤液中以盐存在，加入酸和醋酸丁酯，溶于有机相中，在醋酸丁酯中加入碳酸钾，,6.2-7.2,，形成盐转入水相中，实现反萃取。,29,B,、影响萃取因素,a,、,pH,：反复调节,pH,，青霉素不稳定，易发生降解、异构化、重排，,-,内酰胺环是功能性。,b,、温度：加热会加快其降解反应,c,、工艺过程及浓缩倍数，级数越高、纯度越高但收率越低。,d,、微生物污染：杂菌：,-,内酰胺酶和青霉素酰胺酶,e,、萃取时间：青霉素在水中的半衰期,18.5min,。,30,6,、青霉素的精制,制成碱金属盐：,碱金属盐稳定性大；青霉素在水中的稳定性差，水解快。,(1),结晶工艺：,A,、醋酸丁酯中直接结晶：,加入醋酸钾,-,乙醇,-,碳酸钾、丁醇,-,水真空共沸蒸馏。,B,、丁醇,-,水共沸结晶：,青霉素的碱金属盐溶于水，在丁醇中不溶解，稳定，丁醇和水形成二元共沸物蒸出，丁醇带出水分，不断加入丁醇，可使水分不断减少，结晶析出。,31,(2),过滤、洗涤、干燥,结晶后用真空抽滤来处理母液，并用丁醇洗涤。干燥采用真空双锥旋转干燥器，,7,、溶媒回收,采用立式传质塔蒸馏回收。,32,一、斜面培养：,淀粉,1,，硫酸铵,0.3,、玉米粉,0.6,1.0,、氯化钠,0.3,、蛋白胨,0.2,、琼脂,2,、,pH7.0,7.2,37,培养,7,10d,，成熟的孢子灰色略带微红色。,一级种子培养：,豆饼粉,2.5,、葡萄糖,3,、淀粉,4,、蛋白胨,0.5,、酵母粉,0.5,、硫酸铵,0.5,、玉米粉,0.2,氯化钠,0.3,、磷酸氢二钾,0.06,、硫酸镁,0.025,、豆油,0.3,35,培养,72h,，菌丝密集,红霉素的发酵生产,33,二级种子：,豆饼粉,2.2,、葡萄糖,3,、淀粉,4,、蛋白胨,0.5,、酵母粉,0.5,、硫酸铵,0.1,、玉米粉,0.8,、氯化钠,0.3,、碳酸钙,0.6,、豆油,0.3,35,，,24h,，接种量,10,二、发酵罐培养,发酵培养基：,豆饼粉,2.4,、葡萄糖,3,、,3.5,、蛋白胨,0.5,、酵母粉,0.5,、硫酸铵,0.1,、玉米粉,0.8,、氯化钠,0.3,、碳酸钙,0.6,、豆油,0.15,，丙酸,0.6,（分次加入）,60h,前,35,，,60h,后,33,34,菌丝繁殖期：,接种,45h,后，菌丝生长快，繁殖旺盛，迅速利用,N,、,C,，菌丝体密集成网状。,红霉素分泌期：,45h,150h,，菌丝体生长减弱，并达到平衡，,pH,在,7.2,左右，,c,源利用较快，红霉素持续分泌。,菌丝自溶期：,菌体衰老，发酵液颜色较深，菌丝短，粘稠度较大，,pH,上升,7.5,，氨基氮上升。,35,3,、红霉素的提取和精制,红霉素是一种有机碱化物，在碱性条件下溶于有机溶剂中，在酸性条件下溶于水中。,36,提取工艺,发酵液 过滤,滤液 酸化液,加甲醛、硫酸锌,pH8.2,8.8,(26000 r/ml),加氢氧化钠静止,碱化,调节,pH10,105,分层、离心,醋酸调节,pH5,5.5,静止分层,酸化液,5,加丙酮,冷冻结晶,结晶,洗涤,干燥,成品,37,1,、发酵液预处理,0.1,0.2,甲醛：杀菌使蛋白凝集变性,4,6,硫酸锌：去除酸性蛋白，助滤,并用碱液调节,pH8.2,8.8,，稳定红霉素,2,、滤液处理,计算添加醋酸丁酯添加量，用碱液调节,pH10,10.5,，,30,33,左右，红霉素溶解于有机溶剂中。,气流干燥,80-90,C,38,3,、醋酸丁酯液处理：,10,醋酸调节,pH5,5.5,，分层，去除醋酸丁酯液，在酸性环境下溶于水溶液中分层过滤,酸液处理,用,10,氢氧化钠调节,pH7,8,，再加适量的醋酸丁酯，二次萃取。,静止分层最终得到溶解于水中的红霉素,再经过冷冻结晶，真空干燥得纯品。,39,