流式细胞术基本原理1.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,流式细胞术基本原理,产品技术专员,流式细胞术,流式细胞术（,Flow Cytometry,简称,FCM,）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选,研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等,研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量,2,流式细胞仪的特点,单个细胞,/,生物颗粒分析,同时多参数、多荧光分析,高通量检测,/,高速度,10000,个细胞,/,秒以上,定性,/,定量分析,分选特定性状或功能的细胞,可检测的样本种类多样,(1),外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体组织，培养细胞,(2),血清、血浆、培养上清、细胞裂解液,3,目前流式细胞仪可以检测的类别,细菌,浮游生物,DM,：,0.2m,15m,单核细胞,中性粒细胞,淋巴细胞,红细胞,4,5,流式细胞仪的基本构造,激光发射器,发出所需要的波长的激光,前向散射光检测器,侧向散射光检测器,光学滤镜,流动室与液流系统,：将细胞单个压入流动室,信号收集与数据处理系统,光源与光学系统,6,Injector,Tip,荧光信号,聚焦的激光光束,鞘液,流动室,7,当光子遇到滤片时，光子或通过滤片，或被滤片吸收，或被滤片反射。,光学滤片,8,光学滤片的种类,长通滤片（,LP,）：,630LP,短通滤片（,SP,）：,550SP,带通滤片（,BP,）,:488/10,9,10,共有两类：,散射信号,与,荧光信号,前向角,散射,信号（,FSC,）,反映细胞,大小,侧向角,散射,信号（,SSC,）,反映细胞,颗粒度,荧光信号（,FL Signals,）（,FL1,、,2,、,3,）,胞内、胞外,染色情况,流式细胞仪可获取的信号种类,11,FSC,和,SSC,直方图,流式细胞仪显示图的种类,12,把前向散射光图和侧向散射光图的一维图像在二维图像上投影，便是我们平常所看到的流式图。,所以横坐标表示的是细胞的直径大小；纵坐标表示的是细胞的复杂程度。,两者相结合就能说明细胞种类,散点图,13,二维等高图和密度图,14,假三维图与三维图,Pseudo 3D Plot,3D Plot,15,流式细胞仪如何获取细胞信号？,FSC,SSC,FL,16,前向角信号（,Forward Scatter,，,FSC,）,17,前向角信号：细胞的大小,18,FSC,Count,FSC,Count,10,1000,19,侧向角信号（,Side Scatter,，,SSC,）,20,SSC,Count,SSC,Count,10,1000,21,FL,22,count,FL,23,FSC,、,SSC,、,FL,24,如何分离,90,角内的各种荧光信号？,25,荧光染料,吸收某一波长的光波后能发射出大于吸收光波长的光波的物质,激发光,PI,488n,600nm,26,荧光染料种类,荧光染料 激发波长,(nm)发射波长,(nm),用途 颜色,FITC 488 525,免疫荧光,绿色,PE(RD1)488 575,免疫荧光,橙色,PerCP 488 670,免疫荧光,红色,PI 488 620 DNA,染色,橙红,ECD 488 620,免疫荧光,橙红,PeCy5 488 675,免疫荧光,红色,APC 633 670,免疫荧光,红色,DAPI 359 462,DNA,染色,蓝色,27,荧光染料光谱特征,28,荧光分离原则,在流式细胞仪中，一般经过,LP,或,SP,滤片将荧光大致分开后，再经过一,BP,滤片分离出特征荧光,29,开放式光路,Calibur,、,Influx,流式细胞仪的光路,30,封闭式光路（,Canto,、,LSR,系列、,Aria,系列）,31,分选,将目标细胞分离并富集，进行后续研究。,分选纯度,99%,32,震荡,激光,33,偏转板,Fluorescence Activated Cell Sorting,488,nm,laser,+,-,Charged Plates,Single cells sorted,into test tubes,FALS Sensor,Fluorescence detector,34,几个概念,信号放大模式,信号类型,CV,值,样本流速,激光延迟,液滴延迟,荧光补偿,阈值,门,对照,35,信号放大,PMT,将光信号转换成电信号，调整,PMT,的电压，信号强度将随之改变,光信号,光电倍增管（,PMT,）,放大器,电信号,放大器两种放大方式：,线性放大（,lin,）,对数放大（,log,）,36,线性放大（,lin,）,按光强度的线性关系输出信号,.,适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物过程的信号，如,DNA,含量、总蛋白含量等。,37,对数放大（,log,）,按光强度的对数关系输出信号,.,在免疫学测量中通常使用对数放大。,38,电脉冲信号类型,将与电脉冲信号,强弱相关的电压,数字化,有三类电脉冲信号,高度信号,H,面积信号,A,宽度信号,W,39,CV,值,CV,值（变异系数）：,样品均一度及仪器分辨率的标志,CV,值一般2%,40,样本流速,41,高流速,：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快,但,分辨率低,.,低流速,：一般用于对,分辨率要求较高,的分析，如,DNA,分析。,样本流速选择,42,激光延迟（,laser delay,）,Laser 1,Laser 2,43,液滴延迟（,drop delay,）,44,颜色补偿,采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差。在完成双色以上荧光标记的样本时，都需要作颜色补偿。,45,FITC,主要由,FITC,的检测器检测，但部分光也会进入,PE,检测器。如果单染,FITC,，同时打开,PE,检测器，则如图：,理想状态,实际情况,补偿效果,阴性对照,46,阈值,信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常来自于碎片。通过设定某一信号的最低强度值，可将不需要的脉冲信号去除，这一设定值称为阈值,。,屏蔽噪音信号和碎片信号,47,门（,Gate,）,分析,/,分选感兴趣的细胞群,48,对照,同型对照：为没有特异性、与荧光抗体蛋白亚型一致的免疫球蛋白，通常是未进行免疫小鼠血清的纯化,IgG1,或,IgG2,，用于检测和消除（一抗）,非特异性结合,到组织细胞而产生的,背景染色,。,空白对照：即不进行标记的细胞。主要用于确定待测标本的,基础荧光阈值,或检测染色方法时候成功。,阳性对照：即已知表达某种抗原的细胞（阳性细胞）进行平行实验，通常用于检测,抗体是否有问题,或确定实验方法的稳定性、准确性。,49,谢谢！,50,此课件下载可自行编辑修改，供参考！,感谢您的支持，我们努力做得更好！,51,