单克隆抗体制备44250.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,问题：,1,、什么叫动物细胞融合？植物体杂交技术与动物细胞融合有什么不同呢？,2,、动物细胞在结构上有何区别？这与它们杂交或融合过程有什么影响？,3,、动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理是否相同？两者的融合过程是否也一样？,动物细胞融合与单克隆抗体,.,1,、动物细胞融合,细胞融合是正常的生命活动,两个细胞正在融合,受精作用,.,动物细胞融合,.,动物细胞融合,.,细胞,A,细胞,B,杂种细胞,灭活的病毒,物理法,化学法,仙台,病毒,疱疹,病毒,新城鸡瘟,病毒,.,用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程细胞核,病毒颗粒,细胞核,.,细胞融合与融合诱导细胞融合物质：,诱导剂：仙台病毒、聚乙二醇诱导细胞融合的仙台病毒必须,灭活,。,思考讨论：,为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？不灭活行吗？,因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂,质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭,活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。,细胞融合技术应用于哪些方面？,细胞学、遗传学、免疫学及制备单克隆抗体。,.,2,、单克隆抗体,什么是抗体？,抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。,B,淋巴细胞产生抗体。,.,抗体与相应抗原特异性结合,.,B,淋巴细胞与抗体的关系B,淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。,、动物体内的,B,淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。,、每一个淋巴细胞只能产生一种抗体,。,所以传统的抗体的生产方法及缺陷是什么？,怎样解决这个问题？,.,血清抗体（也称多克隆抗体）,由,血清,中提取的抗体是由不同淋巴细胞产生的多种抗体的混合物，可达百万种以上，称为,多克隆抗体。,特点：,产量低、纯度低、特异性差、反应不够灵敏。,抗原不纯,抗体不纯,抗原,动物体内,刺激,效应,B,抗体,.,每一个,B,淋巴细胞只分泌一种,化学性质单一，特异性强的抗体,。,如果利用单个,B,淋巴细胞进行无性繁殖（克隆），形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出,化学性质单一,、,特异性强,的抗体,单克隆抗体,。,问题：,怎样获得化学性质单一、特异性强的抗体呢？,.,在体外培养的条件下，一个,B,淋巴细胞能无限增殖形成细胞群吗？,什么样的细胞能够在体外无限增殖呢,？,肿瘤细胞！,.,科勒,米尔斯坦,荣获,1984,年诺贝尔生理学或医学奖,如果把一种,B,淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞进行融合，所得到的,融合细胞,既能大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体。,.,单克隆抗体,由单个,B,淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。,特点：特异性强、灵敏度高,.,如何大量生产单克隆抗体？,利用淋巴细胞产生抗体的功能,利用肿瘤细胞无限增殖的特性,利用细胞融合的技术将,两种细胞融合,获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的,杂交瘤细胞,利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞,如何筛选？,融合方式？,.,如何诱导融合？,加入聚乙二醇（,PEG,）,如何得到,B,淋巴细胞？,3.,制备,单克隆抗体的,过程,.,细胞两两融合后，有哪些类型？,B-B,B-,瘤,(,杂交瘤细胞,),瘤,-,瘤,如何筛选出杂交瘤细胞？,单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。,首先用选择培养基筛选出杂交瘤细胞,.,HAT,是次黄嘌呤（,h,ypoxantin,）、,氨基蝶呤（,a,minopterin,）,和胸腺嘧啶脱氧核苷（,t,hymidin,）三种物质各英文首字，,HAT,培养基也就是指含有这三种物质的细胞培养基。,.,细胞合成,DNA,的原料,脱氧核苷酸,的合成具有两个途径：,1,、,起始合成（,de novo pathway D,途径）,2,、补救（亦称替代或称中间）合成途径，（,salvagepathway S,途径）即,用“次黄嘌呤（,H,）”和“胸腺嘧啶脱氧核苷（,T,）”为原料进行,补救合成。,.,用,HGPRT,型,瘤细胞，即缺乏,次黄嘌呤鸟嘌呤,磷酸核糖转移酶（,hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase,）,缺陷型,变异株瘤细胞（,本身,无补救,合成途径,无,S,途径，,只有起始合成,途径,有,D,途径），与脾脏的,B,细胞融合。,.,瘤细胞,本身,无补救,合成途径（,S,alvage pa-thway,）（不能利用培养基中的,H,和,T,），只有,起始合成,途径,D,途径合成,DNA,。（,瘤细胞,无,氨基喋呤时）只能利用,起始,合成途径（,D,e novo pathway,）,D,途径（利用谷酰胺与,尿,核苷酸单磷酸）,合成,DNA,；,有,氨基喋呤（,A,）,，则,D,途径被氨基喋呤所阻断。,.,杂交瘤细胞具有来自脾淋巴细胞的,两个途径，,次黄嘌呤,-,鸟嘌呤,磷酸核糖转移酶,HGPRT,，,起始,合成途径（,D,e novo pathway,），,被,氨基喋呤,所阻断。但还,有补救,合成途径（,有,S,途径）起作用。,.,脾淋巴细胞与杂交瘤细胞一样：，两个途径中，,起始,合成途径,D,途径（,D,e novo pathway,），虽,被氨基喋呤所阻断，但还有,补救,合成途径（,S,途径）。但是，本身是高度分化的细胞，不能分裂。,.,次黄嘌呤,“,次黄嘌呤”,(,英语,:Hypoxanthine),也称“,6-,羟基嘌呤”,是一种天然存在的嘌呤衍生物6-,氨,基嘌呤，就是腺嘌呤。,.,阳性,孔,方法,抗原,-,抗体杂交法,第二次在,多孔培养板,上筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，,.,如何得到大量的单克隆抗体？,体内培养,体外培养,单克隆抗体,化学性质单一、特异性强,.,2.,技术思路的重点,杂交瘤细胞,HAT,筛选,McAb,大量培养,PEG,诱导细胞融合,免 疫,B,脾,矿物油,骨髓瘤,瘤,关键一步,单克隆抗体（,McAb,）,.,.,单克隆抗体制备过程,.,单克隆抗体制备过程,注射抗原,B,淋巴细胞,骨髓瘤细胞,细胞融合、筛选,杂交瘤细胞,细胞培养,筛选，继续培养,足够数量的、能产生特定抗体的细胞群,体外培养,注射到小鼠腹腔,单克隆抗体,.,.,思考：,1,、本过程利用了哪些原理？,免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理,2,、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与,B,细胞融合,？,这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有,B,细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体,.,单克隆抗体的应用,与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显。,应用主要有：,1,、临床诊断,2,、作为载体，运载抗癌药物，形成,“,生物导弹,”,治疗肿瘤,资料：,目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内,“,病灶,”,也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。,.,4,、单抗隆抗体的应用,作为诊断试剂,定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病,用于体外诊断人类和动植物疾病及病原鉴定，,纯度高、特异性强,，具有,准确、高效、简易、快速,的优点。,用于治疗疾病和运载药物,利用同位素标记单抗，在特定组织成像,制成,生物导弹,，将药物定向带到癌细胞所在的位置，在原位杀死癌细胞，疗效高、副作用小。,单克隆抗体的优点：,特异性强，灵敏度高，并可以大量制备。,.,.,.,用于治疗疾病和运载药物,特异性强、灵敏度高生物导弹,单克隆抗体抗癌药物,疗效高、毒副作用小,结合同位素的单抗,-,生物导弹,.,结合同位素的单抗,-,生物导弹,单抗,放射性同位素,.,项目,动物细胞融合,植物体细胞杂交,原理,细胞膜的流动性,细胞膜的流动性和植物细胞的全能性,融合前提,分散成单个细胞,去除细胞壁,诱导方法,聚乙二醇、离心、振动、电激、,灭活病毒,聚乙二醇、离心、振动、电激、,结果,获得杂种细胞或细胞产物,获得杂种植株,用途,制备单克隆抗体,培育作物新品种,意义,使远缘杂交成为可能,克服远缘杂交障碍,.,植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较,比较项目,植物体细胞杂交,动物细胞融合,细胞融合原理,细胞膜的流动性,、,细胞膜的流动性,细胞融合的方法,去除细胞壁后诱导原生质体融合,使细胞分散后诱导细胞融合,诱导方法,物理（离心、振荡、电刺激）,化学（聚乙二醇）,物理、化学方法（同左）,灭活的病毒,用途,获得杂种植株,制备单克隆抗体,.,小结：,两个过程,动物细胞培养过程,单克隆抗体制备过程,三个,“,一,”,一个诱导细胞融合的新方法灭活病毒,一个新细胞杂交瘤细胞,一个优势单克隆抗体特异性 强、灵敏度高的优势,.,1.,动物细胞工程技术的基础是：（）,A,动物细胞融合,B,胚胎移植,C,动物细胞培养,D,核移植,课堂训练,.,在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是,（）,A,结果是相同的,B,杂种细胞的形成过程基本相同,C,操作过程中酶的作用相同,D,诱导融合的手段相同,.,.,单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和,B,淋巴细胞,诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，,在这种培养基上不能存活增殖的细胞是,（）,淋巴细胞,小鼠骨髓瘤细胞,B,淋巴细胞自身融合细胞,小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞,杂交瘤细胞,A,B,C,D,C,.,4,、下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案,(2),、该方案能达到预期效果吗？为什么？,(4),、图中,B,为,_,过程，常用,_,作为诱导剂，该细胞继承,_,的遗传特性，既能,_,又能,_,。,(1),、该实验方案的目的是,_ _,(3),、,A,是从小鼠的脾脏中取得,_,该细胞能够产生,_,(5),、,C,过程指细胞培养，该过程包括,_,培养和,_,培养两个阶段，其中,_,代以内的的细胞属于细胞株。,制备单克隆抗体,B,细胞,抗体,细胞融合,灭活病毒,双亲细胞,分泌抗体,无限增殖,原代,传代,50,B,体外培养,骨髓瘤细胞,杂交瘤细胞,足够数量的细胞群,注射到,小鼠腹腔,A,C,.,