治疗性抗体研发的进展和关键技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,.,*,1,治疗性抗体研发的进展和关键技术,2,主要内容,治疗性抗体研发概况,治疗性抗体研发的主要进展,治疗性抗体研发中要注意的问题,3,4,5,用抗体药物治疗的疾病,肿瘤,自身免疫病,感染性疾病,抗移植排斥,心血管疾病,骨质疏松,罕见病,眼黄斑变性,炭疽,6,抗体结构与功能关系,7,抗体药物的作用机理,直接效应 诱导凋亡,抑制增殖,阻断生长因子或生长因子受体,干扰血管生成,间接效应 依赖补体的细胞毒（,CDC,）,依赖抗体的细胞毒（,ADCC),作为毒素、放射性同位素和细胞,毒药物的载体,形成抗独特型抗体通过双特异性抗体靶向效应细胞,8,抗体药物在临床应用中面临的挑战,免疫原性,杀伤靶细胞的活性弱,成药性问题,新靶点,9,抗体药物研发的主要进展,降低抗体的免疫原性,改变抗体的效应功能,提高抗体表达量,引入先进的抗体表征和质控方法,改进抗体规模化生产技术,新靶点的发现,10,CDR,移植,FR,移植,SDR,移植,表面氨基酸重塑,Phage display,转基因鼠,单细胞,PCR,人工设计,抗体人源化和人源抗体,11,人源抗体制备的主要技术,EB,病毒转化人,B,细胞,人,-,人杂交瘤技术,抗体库技术,转基因小鼠,人工设计和合成人源抗体,12,抗体库技术,转基因小鼠,13,人工设计和合成人源抗体,Her2,晶体结构,D4,SDS-PAGE,非还原电泳,155KDa,HF,人源表达抗体的纯化和功能鉴定,HF,人源抗体基因合成、构建、表达,人源化抗体设计、虚拟筛选,抗体专家分析系统,抗原抗体复合物结构信息分析,HF,人源抗体对,Her2,+,+,细胞的,ADCC,杀伤效应分析,HF,SKVO3,Her2,+,MCF7-Her2,+,Herceptin,SKVO3,Her2,+,MCF7-Her2,+,HF,人源抗体对,Her2,靶点的特异性识别,1986,1994,1997,1998,2000,2001,2002,2003,2004,2006,2007,2008,2009,2010,2011,2012,鼠源,嵌合,人源化,人源,FDA,批准的抗体药物,OKT3,ReoPro,Rituxan,Zenapax,Simulect,Synagis,Remicade,Herceptin,Enbrel,Mylotarg,Campath,Zevalin,Humira,Xolair,Bexxar,Raptiva,Avastin,Erbitux,Tysabri,Lucentis,Vectibix,Soliris,Cimzia,Actemra,Stelara,Simponi,Ilaris,Arzerra,Numax,Prolia,ABThrax,Benlysta,Yervoy,Perjeta15,第二代抗体药物,抗,TNF adalimuab(Humira,，全人抗体）,certolizumab,（,Cimzia,，,PEG,修饰的,Fab,）,golimumab,（,Simponi,，全人抗体）,抗,CD20 ofatumumab,（,Arzerra,，全人抗体）,抗,RSV motarizumab,（亲和力更高）,抗,EGFR panitumumab,（,Vectibix,，全人抗体,）,16,抗体效应功能的改造,定点突变改造,Fc,改变糖基化,双特异性或多特异性抗体,17,减弱抗体的效应功能,Fc,上进行定点突变,Teplizumab(Leu234Ala,Leu235Ala),去糖基化,Otelixizumab(,去糖基化，,Asn297Ala),选择,IgG4,亚型或杂合亚型（,IgG2/IgG4,）,Fc,融合蛋白,18,提高抗体的效应功能,双特异性抗体,改变抗体,效应功能,偶联细胞毒物质,抗体,Fc,突变,改变抗体糖基化,细胞内抗体,抗体融合蛋白,19,20,1,抗体,Fc,突变提高效应功能,突变,Ser239Asp,，,Glu330Leu,，,ILe332Glu,提高,ADCC,突变,Gly236Ala,，,Ser239Asp,，,ILe332Glu,提高,ADCP,和,ADCC,杂合,IgG,亚型提高,CDC,突变,Met252Tyr,，,Ser254Thr,，,Thr256Glu,增加抗体的半寿期,21,2,改变抗体,Fc,的糖基化,22,各种糖基化变化对抗体功能的影响,来自潘海报告,23,第三代抗体药物,抗,CD20 obinutuzumab,（糖基化改造，提高,ADCC,）,AME-133v(Fc,改造，提高,ADCC),TRLI-05(Fc,改造，提高,ADCC),Pro13192(Fc,改造，提高,ADCC),抗,RSV/F MEDI-557(Fc,改造，增加半寿期,),24,3,抗体上偶联细胞毒物质,25,26,单抗,:,癌细胞表面过量表达的抗原且能内吞。,偶联链,:,在血液中稳定但可以在细胞内释放毒素。,毒素药物,:,需要极毒的可以抑制细胞生长的化合物,赖氨酸 偶联,轻重链间二硫键偶联,定点偶联,KADCYLA(T-DM1),Genentech/Immunogen,ADCETRIS(aCD33-vcMMAE),Seattle Genetics,Thio-Mab or Ambrxs unnatural AA incoporation,抗体,-,药物偶联技术,27,FDA,批准的,ADC,药物,放射性同位素，,Bexxar,Zevalin,毒素,小分子药物，,Mylotarg,，,T-DM1,Adcetris,28,4,双特异性抗体,29,欧洲上市的双特异性抗体,30,在临床试验的双特异性抗体,抗体名称,靶抗原,临床试验,SAR156597,IL4,x IL13,Phase I,AFM13,CD30,x CD16A,Phase I,FBT-A05,Bi20,CD20,x CD3,Phase I,MT110,EpCAM,x CD3,Phase I,MT111,MEDI565,CEA,x CD3,Phase I,IMCgp100,Gp100,x CD3,Phase I,TF2,CEA,x IMP288 hapten,Phase I,MEHD-7945A,EGFR,x HER3;dual IgG1,Phase I,MM-111,HER2,x HER3,Phase I,CVX-241,Ang2,x VEGF;dual IgG1,Phase II,Ozoralizumab ATN103,TNF,x albumin,Phase II,31,5,免疫细胞因子,32,靶抗原选择,针对已确认过的靶,临床确认,实验确认,寻找新的功能性靶抗原,33,自身免疫病的治疗靶,34,上市抗肿瘤抗体药物的靶抗原,靶分子 适 应 症,CD20 NHL CLL,HER2,乳腺癌,CD52 CLL,EGFR,结肠癌,VEGF,结肠癌 肺癌,CD33 AML,CTLA-4,黑色素瘤,CD30,淋巴瘤,35,36,37,发现药物靶标的主要方法,分子流行病学调查,人类遗传学研究,人类功能基因组学,蛋白组学,生物信息学,药理学,模式动物,38,候选基因,可成药的候选药靶,与疾病的相关性,39,治疗性抗体研发中要注意,的问题,抗体分子结构特点：,四条肽链，重链糖基化，结构上有较多二硫键,L,40,Protein expression,Solubility,stability,抗体结构与成药性的关系,41,Master Cell Bank,Working Cell Bank,Raw Materials,Small-scale Cell Culture,Large-scale Cell Culture,Product Recovery,Product Filtration,Formulation,Pool Bulks,Sterile Filter,Fill,and Partial Stopper Vials,Lyophilize,Cap Vials,Liquid Products,Product Inspection,Container Integrity Testing,Labeled Final Vial Product,Packaging,单抗体生产工艺和过程,Drug,Substance,李锋,Drug,Product,42,从细胞表达到病人临床注射，单抗体药物可能发生多种反应变化,细胞培养,配伍制剂,和储藏,分离纯化,临床注射和,新陈代谢,酶糖基化,化学糖基化,还原反应,序列变异,还原反应,水解反应,聚合化,氧化反应,异构化,化学糖基化,脱氨基化,巯基半胱胺酸化,酶降解反应,理化分析和质量控制对于抗体制药工业各个环节起着支持和指导的重要作用。,如同眼睛对人的作用一样，没有好的分析手段和方法，抗体生产过程就可能走向歧途。,引自张伯彦报告,43,可变区：,选择,Gln,为氨基末端，减少电荷变异,突变,CDR,区上不稳定的点,突变某些氨基酸，避免抗体聚合,去除可变区上的糖基化位点,恒定区：,铰链区改造避免出现半个抗体和不规则,二硫键或异型结构,提高与,FcRn,结合，增加血清半寿期,影响抗体药物稳定性和效能的因素,单抗体药物产品是各种变异体的混合物,电荷变异体,by iCIEF,7.0,7.2,7.4,76,7.8,8.0,8.2,8.4,8.6,8.8,9.0,9.2,9.4,Lower pI Marker,Upper pI Marker,Main Peak,54%,Acidic Variants,28%,Basic Variants,18%,序列变异体,by Tryptic Peptide Map,Clone#,M83R,体积变异体,by SEC,二聚体,脱氨基化,(32),Met,氧化,(22),糖基化（,22),高甘露糖化,G0,G1,G1,G2,（,5,）,唾液酸化（,5,）,C-,端,Lys,（,2,）,2644552=9600,(9600),2,10,8,约,1,亿个可能的变异体！,美国,FDA,：,Steven Kozlowski,基因特克：,Wassim Nashabeh,O,O,D,D,D,G,G,K,K,pyro-E,O,D,G,G,D,O,D,pyro-E,45,Amidation(C-term)*,Di-,tri-sulfide bond formation N,O-Glycosylation,C-mannosylation(W),Proteolytic processing(C-term),Sequence Variants,Oxidation(M,W,H,F,Y),S-Cysteinylation,Disulfide scrambling,S-Glutathionylation,Thioether formation,Reduction,Deamidation(NG,NT,NS),Isomerization(DG,DS,DD),Transamination,Glycation(K),Hydrolysis(DP),1,。影响抗体质量的蛋白表达后修饰细胞内细胞外都有发生；,2,。质控的目标是降低或避免在生产过程中不希望看到的,PTM,和序列变异,发生的现象。,克隆筛选是质量控制的关键步骤,mAb Variants and Characterization Methodologies,Size Variants(,体积变异体）,Terminologies,:Aggregates,main peak,fragments,Assays,:HPSEC,CE-SDS,SDS-PAGE,AUC,Charge Variants,（电荷变异体）,Terminologies:,Acidic peak,main peak,and basic peak variants,Assays:,HPIEC,iCIEF,pH-IEC,Sequence Variants,（序列变异体）,:caused by unintended amino acid substitutions,Terminologies:,sequence polymorphism;mutation;mis-incorporation;sequence extension,insertion,deletion,and crossover.,Assays:,Multiple proteolysis peptide mapping methods with LC-UV-MS/MS data analysis,Structural Variants,（高级结构变异体）,Terminologies:,high order structure(HOS);tertiary structural isomer.,Assays:,HDX-MS,hydroxyl radical oxidation foot-printing,other emerging techniques.,46,47,Yang,Y.,et al,mAbs,2010,2:3,285-298,.,Comparison of peptide map UV profiles from the top four clone-derived mAb samples quickly detected two sequence variants(N1:M83R at 5%and N2:P274T at 42%protein levels)from two clones among the four.,UV,肽图对比方式可以发现高含量的序列变异体,肽图对比方式可以发现序列变异体,Slide,48,Slide,48,MIL41,和,mAb1,的质量可比性,分子量,肽图（一级序列）,糖基化位点和程度,糖基化种类,体积变异体分布,电荷变量分布,等电点,pI,结合活性,ELISA,Biacore,亲和力测定,细胞生物学活性,MIL41,mAb1,Tryptic Peptide Mapping,Charge Variant by CEX,VHS variant from mAb1,C-terminal amidation,variant from MIL41,MIL41,是,mAb1,的生物仿制药,.,mAb1,处方经确证完全适合稳定,MIL41,加速，长期稳定性试验初步设定了有效期,稳定性影响因素试验确定了储运条件,制剂处方确证和稳定性可比性研究,生理盐水配伍试验确定静脉滴注条件,稳定性可比性试验确证,MIL41,和国外上市药 稳定性高度一致,高温,30,天：,降解途径高度一致,高温,30,天：,降解速率高度一致,50,谢谢,课件部分内容来源于网络，如对内容有异议或侵权的请及时联系删除！,此课件可编辑版，请放心使用,！,.,