实验室细胞培养基本知识专题培训课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,细胞培养基本概念,细胞培养：,从动物或植物中取出细胞，使其在合适的人工环境中生长。,细胞来源：,细胞可直接从组织中取出并采用酶或机械方法进行解离，也可来自已经建立的细胞系或细胞株。,原代培养：,是指将细胞从组织中分离后，使其在合适的条件下增殖，直到占据所有可用基质,(,即：汇合,),的培养阶段。,传代培养：,在细胞生长至汇合，必须将细胞转移到新的容器中并更换新鲜培养基，为其提供更多继续生长的空间。,细胞系：,首次传代培养后，原代培养物即被称为细胞系。,细胞株：,如果将细胞系的一个细胞通过克隆或者其他方法从培养物中明确地选择出来，就成为一个细胞株。,有限细胞系与连续细胞系：,正常细胞通常只能分裂有限的次数，随后就会丧失增殖的能力，这是一个由遗传决定的事件，被称为衰老；这种只能分裂有限的次数的细胞系被称为,有限细胞系,。但是，一些细胞系会通过“转化”的过程变为永生性细胞系，这一过程可自然发生，也可经化学或病毒诱导发生。有限细胞系发生转化获得无限分裂能力后，就成为,连续细胞系,。,培养条件：,细胞培养的人工环境必须包括合适的容器，容器中含有一定的基质或介质，为细胞提供必需的营养素,(,氨基酸、碳水化合物、维生素、矿物质,),、生长因子、激素和气体,(O2,、,CO2),，并可调节其物理化学环境,(pH,、渗透压、温度,),。,细胞培养基本概念,为什么要细胞培养？,避开机体自身调节和实验应激的整体因素的影响；,环境控制、均一性（可以使用一批同源细胞获得稳定、可重复的结果）、经济、规模和机械化；,细胞培养的应用,细胞培养是细胞和分子生物学中,最重要的一项技术,，可为细胞正常生理和生化,(,例如：代谢研究、衰老研究,),、药物和毒性化合物对细胞的作用以及致突变和致癌研究提供上佳的模型系统。细胞培养还可用于药物筛选和开发以及生物化合物,(,例如：疫苗、治疗性蛋白,),的大规模生产。,细胞培养实验室,一更,二更,一间,二间,三间,走廊,隔间,准备室,细胞培养设备,基本设备：,细胞培养通风橱,(,即：层流通风橱或生物安全柜,),培养箱,(,推荐使用湿式二氧化碳培养箱,),水浴锅,离心机,冰箱和冰柜,(20C),细胞计数器,(,例如：,Countess,自动细胞计数器或血球计数器,),倒置显微镜,液氮,(N2),冷冻柜或冻存容器,灭菌器,(,即：高压灭菌器,),扩增设备：,抽吸泵,(,蠕动泵或真空泵,),pH,计,共聚焦显微镜,流式细胞仪,其他用品：,细胞培养容器,(,例如：培养瓶、培养皿、滚瓶、多孔板,),吸管和移液器,注射器和针头,废物容器,培养基、血清和试剂,细胞系,细胞培养通风橱通过维持工作区域上方稳定、单向的,HEPA,过滤空气流动，保护工作环境免受灰尘及其他空气污染物污染。,气流可以呈水平方向，与工作台面平行吹过，或者也可呈垂直方向，从通风橱上方吹向工作台面。,准备与灭菌,灭菌方式的选择,热稳定的物品（玻璃器皿、金属）用干热灭菌：,160,，,1h,；,热稳定的液体：水、盐溶液和适度热稳定的塑料制品：硅树脂、尼龙、聚丙烯、聚碳酸酯用湿热灭菌：,121,，,20min,；,不耐热液体：过滤除菌；,不耐热物品：射线灭菌,30min,，,70%,乙醇擦拭。,灭菌方式的选择,项目,消毒方式,玻璃器皿,干热,金属制品,干热,带螺口盖的玻璃品,高压灭菌，将盖悬松,玻璃移液管,干热,枪头,高压灭菌,离心管,(5ml,，,15ml,，,50ml),高压灭菌，直立放置,EP,管,(1.5ml,，,2ml,，,5ml,，,10ml),高压灭菌,试管,干热,艾本德移液器（新）,高压灭菌，整支,高压灭菌,过滤,琼脂,氨基酸,蛋白胨,抗生素,EDTA,牛血清白蛋白,甘油,胶原酶,HEPES,药物,甲基纤维素,谷氨酸盐,酚红,生长因子,盐溶液,HCL,水,NaHCO3,NaOH,血清,丙酮酸钠,胰蛋白酶,玻璃器皿、金属器皿的清洗和灭菌,将玻璃和金属器皿放入含有消毒剂（次氯酸钠）和清洁剂（,Decon,）的洗液中，侵泡过夜或至少,2h,（铝、铜制品不得浸泡）,;,试管刷清洗，自来水冲洗,4,次，去离子水冲洗,3,次；,倒置于烘箱中烘干；,铝箔封口保存；,使用前,2448h,，放入干热灭菌箱中，,160,灭菌,1h,，自然冷却后使用；,100,目和,600,目的筛网需要超声清洗。,塑料制品的清洗和灭菌,将塑料制品放入含有消毒剂（次氯酸钠）和清洁剂（,Decon,）的洗液中浸泡,30min,，自来水冲洗干净；,置于超声清洗器中清洗,30min,；,用自来水充分清洗后用去离子水清洗（塑料制品要用专用的刷子或者将自来水连上胶管伸进塑料管内部冲洗）；,将离心管的盖子和管体分开用图纸包起来，直立放入灭菌锅中湿热灭菌,121,，,20min,（高速离心管尤其注意灭菌时要直立放置）；,自然冷却后置于烘箱中烘干。,水的制备和灭菌,细胞培养需要用超纯水（,UPW,）；,第一：反向渗透或蒸馏第二：碳过滤去除有机或无机胶体（总有机碳,TOC,10ug/L,）；第三：去离子（电阻,10M/cm,）；,高压灭菌,121,，,20min,，自然冷却。,PBS,的制备,烧杯中加入,1L,灭菌超纯水；,放在磁力搅拌器上，设定转速,200r/min,；,打开,PBS,干粉（,1L,装）加入烧杯中；,搅拌至完全溶解；,PH,计检测,PH,为,7.4,，变化,0.1,；,分装至灭菌的储液瓶中，盖子只轻旋一圈，放入灭菌锅中湿热灭菌；,自然冷却后盖紧，,4,或室温保存。,配置完全培养基,烧杯中加入,1L,灭菌超纯水，置于磁力搅拌器上，设定,200r/min,，边搅拌边加入,1,袋,DMEM,或,DMEM/F12,干粉（已含,L-,谷氨酰胺和丙酮酸钠）；,用注射器吸取超纯水，将包装袋内残留培养基洗下；,干粉溶解后加入,2.438g NaHCO3,，搅拌至完全溶解；,用,HCl,和,NaOH,调节,PH,为,7.2,，过滤除菌后（,PH,接近,7.4,）,4,保存；,商业胎牛血清,一般是热灭活的，可以直接使用，如果需要过滤，先用,0.22m,滤器过滤后，再用,0.1m,滤器低压过滤才能保证无菌、无支原体。,双抗：,称取氨苄青霉素,0.625g,，链霉素,1g,，,PBS,定容至,100ml,，,4,过夜，过滤除菌分装。,使用时如需配置,200ml,完全培养基，需加入,180ml DMEM/F12,，加入,20ml,胎牛血清，再加入,2ml,双抗即可。,使用时再加入血清的好处,是,DMEM/F12,培养基可以,4,保存,69,个月，而加入血清后只能保存,23,周。,无菌操作技术,无菌操作技术,目的：在干净的培养物和含有微生物的外环境之间建立一个屏障，防止微生物的污染，细菌、支原体、酵母菌、真菌孢子等。,要求：与培养物直接接触的所有材料必须无菌（物品无菌），培养物和它的非灭菌环境之间不能有直接接触（环境无菌）。,要素：无菌工作区域、良好的个人卫生、无菌试剂和培养基以及无菌操作。,无菌工作区域,洁净台的使用,在一个十分干净的工作台上开始工作,（什么都没有）,；,用,70%,乙醇充分擦洗紫外灭菌,30min,；,只把需要的物品（确保充分灭菌或用,70%,酒精擦拭）放入工作台内，,洁净台不可用做储存区域；,将工作区的物品整理好（中央宽敞、容易拿取、拿取时不跨越物品、不遮挡层流）；,随时移走不再需要的物品；,要在视野范围内操作；,如有任何溢出物需随时擦去，并用,70%,乙醇擦洗；,实验完毕要移走洁净台里的所有物品（什么都没有），并用,70%,乙醇彻底擦洗工作面，然后紫外灭菌,30min,；,在通风橱中部开阔区域放置细胞培养容器,移液器置于右前方易于取用的地方,试剂和培养基置于右后方，便于吸取,试管架置于中后部，用于固定其他试剂,小型容器置于左后部，用于盛放废液,良好的个人卫生,洗手、戴上,PE,手套；,更换洁净服（长款）；,女生要将头发扎在身后；,戴上乳胶手套；,操作中经常进行手消毒（自动手消毒机）；,如进行有生物危险的实验时，需要,P2,实验室、生物安全柜、保证无裸露的皮肤。,外来试剂、培养基和培养物的无菌,商品化试剂和培养基经过严格的质量控制以确保其无菌性，但其瓶子的外表面不是无菌的，新采购的试剂瓶子以及从冰箱或水浴槽中拿出来后，要用,70%,酒精擦拭灭菌再放入洁净台内。,自己配置的所有试剂、培养基和溶液必须采用适当的灭菌方法,(,例如：高压蒸汽、无菌过滤,),进行灭菌。,引进的培养物（如购买的细胞系）是高危污染源，要先经过检疫，并坚持用不含抗生素的培养基培养直至证明没有污染。,细胞培养箱的无菌,培养箱是主要的污染源，应每学期做彻底清洁（箱体、架子、隔板、托盘），可用,70%,酒精充分擦拭，并完全挥发晾干。,培养箱使用时底部湿盘要加入,1%,硫酸铜。,培养细胞时，尽可能选购带渗透盖的培养瓶，不仅可以在,CO2,环境中迅速达到平衡，而且不会有污染的危险。,细胞培养中的无菌操作,紫外灭菌：,洁净台使用前、使用中的间隙、使用后都要用紫外灭菌，但光束的有效性有限，因为它不能达到缝隙中。,70%,酒精擦拭：,洁净台使用前、使用中有溢出物、使用后都要擦拭，各种试剂瓶、储液瓶、培养瓶、培养板和培养皿，放入洁净台之前，必须用,70%,乙醇擦拭其外部，注意要选用抗乙醇的记号笔。,移液：,使用无菌玻璃吸管或一次性塑料吸管和移液器操作液体；每支吸管只能使用一次，以免交叉污染。使用时方可打开无菌吸管的包装。吸管应始终位于工作区域内。,一般移液操作用移液管和电动移液器，微量移液操作（,1ml,及以下）用移液器，一次为多个器皿分装液体用注射器，只有灭菌的部分（移液管、枪头、注射器）可以伸进无菌容器内（储液瓶、细胞培养瓶），移液时避免使吸管尖端触碰到任何非灭菌物品包括瓶口螺纹的外缘。,细胞培养中的无菌操作,加盖：所有试剂瓶子要用深螺旋的聚丙烯盖子，使用时要将盖子口朝下放置在工作区域，不用时要及时盖好，但可以不用旋紧。,灼烧：开放工作台才需要灼烧，细胞培养用的洁净台中不需要也不建议灼烧、,明火既破坏了层流又难以除去生物危害物质，还带来了火灾隐患，明火带来的高温还会影响,HEPA,过滤的寿命。,试剂瓶和培养瓶的操作：在洁净台内可以使试剂瓶口敞开直立，但不能让手或其他物品在开口的容器或无菌吸管的上方往来。,倒出液体：任何时候都不要从试剂瓶或培养瓶中直接倾倒培养基和试剂。,小结,保持一个干净有调理的工作空间，并仅在需要的时候才在其中工作。,尽可能的预先准备好再开始操作，使培养物在培养箱外停留最短的时间，而且要做到各种操作快速、简便和顺利。,保持能看到操作面上的每样东西，时时警惕无菌面和非无菌面的偶然接触。,实验完毕后，保持工作区的干净整洁。,污染,化学污染：,培养基、血清和水中的杂质、内毒素、增塑剂和去污剂；,生物污染：,细菌、霉菌、酵母、病毒、支原体以及其他细胞系的交叉污染。,细菌：,通常被细菌污染的培养物呈云雾状,(,即：浑浊状,),，有时表面会覆盖一层薄膜。另外，经常还会发现培养基的,pH,值突然降低。在低倍显微镜下可见，细菌为细胞之间移动的微小颗粒，在高倍显微镜下观察可以分辨出各个细菌的形状，有球状、杆状和螺旋状等。图为被大肠杆菌污染的,293,细胞,酵母：,培养物被酵母污染后也会变得浑浊，,但,pH,值变化极小，污染严重时,pH,值才会升高。在显微镜下，酵母呈单个卵圆形或球形颗粒，有些会芽生出较小的颗粒。图为,293,细胞被酵母污染。,霉菌：是真菌界的一种真核微生物，以被称为菌丝的多细胞丝状体形式生长。在显微镜下，菌丝体通常呈细束状纤维，有时呈较为密集的孢子团块。,病毒：,是一种微观感染性物质，利用宿主细胞结构进行复制。病毒体积极小，因而要检测培养物中有无病毒以及将其从细胞培养实验室所用试剂中去除都十分困难。使用病毒感染的细胞培养物时却会对实验室工作人员造成严重的健康威胁，特别是当实验室培养的是人或灵长类动物细胞时。,支原体：,是一种没有细胞壁的简单细菌，被认为是能够自我复制的最小的生物。由于体积极小,(,一般小于,1,微米,),，支原体的检测十分困难。可在培养物中持续存在造成慢性支原体感染，而不会导致细胞死亡，表现为：细胞增殖速度降低、饱和密度下降以及悬浮培养物凝集；,MycoFluor,支原体检测试剂盒：,A,固定细胞无污染，,B,固定细胞支原体污染，,C,活细胞支原体污染。,抗生素的使用,细胞培养时不应常规使用抗生素，因为连续使用抗生素会促进抗生素耐药性细胞株的产生，导致轻度污染持续存在。一旦将抗生素从培养基中去除，这种轻度污染最终将发展成大规模污染，而且连续使用抗生素还会掩盖支原体感染及其他隐性污染。,另外，有些抗生素会与细胞发生交叉反应，干扰您研究的细胞过程。,抗生素只能作为对付污染的最后手段而且只能短期使用，并应尽快撤除。,如果长期使用抗生素，则应同时进行无抗生素培养，以便作为鉴别隐性感染的对照。,细胞培养基本知识,获取细胞,您可以通过原代细胞建立自己的培养系，或者也可选择从商业供应商或者非盈利性供应单位,(,即细胞库,),处购买已经建立的细胞系。,声誉良好的供应单位可提供优质的细胞系，而且会认真地对细胞系进行检测，以确保其完好性，并且未被污染。,不建议从其他实验室借用细胞，因为这会带来很高的污染风险。,无论来源如何，使用细胞之前都应确保所有新到细胞系已经过支原体污染检测。,培养环境,物理化学环境：温度、,pH,值、渗透压、,O2,和,CO2,；,生理环境：激素和营养素浓度；,培养方式：一种是使细胞在人工基质上单层生长,(,即：贴壁培养,),，另一种是使细胞在培养基中自由漂浮生长,(,悬浮培养),。,除造血细胞系和其他一些细胞外，大多数脊椎动物细胞均具有贴壁依赖性，必须在合适的基质上培养，且该基质必须经过特殊处理，以便细胞粘附和伸展。,培养基：培养基是培养环境中最重要的成分，因为它可提供细胞生长所必需的营养素、生长因子和激素，并能调节培养体系的,pH,值和渗透压。培养基可分为三类：基础培养基、减血清培养基和无血清培养基，三者对血清添加量的要求不同。,血清：,是基础培养基中极为重要的细胞生长和粘附因子、激素、脂质和矿物质来源。此外，血清还可调节细胞膜通透性，并可作为向细胞内运送脂质、酶、微量营养素和微量元素的载体。但是，,在培养基中添加血清也有一些缺点，,包括：成本高，存在标准化、特异性和变异性问题，具有一些不良效应，如：可促进或抑制某些细胞的生长或功能。,pH,值：,大多数正常的哺乳动物细胞系都能在,pH,值为,7.4,的环境中生长良好，而且不同细胞株间差异极小。但是，目前发现有些转化细胞系在轻度偏酸性的环境,(pH 7.07.4),中生长较好，而有些正常的成纤维细胞系更适合轻度偏碱性的环境,(pH 7.47.7),。可通过添加有机缓冲盐,(,例如：,HEPES),或者二氧化碳,-,碳酸氢盐缓冲盐来缓冲 细胞培养中的,pH,值变化。,二氧化碳：,通常使用浓度为,5%,的二氧化碳来控制培养体系的,pH,值，大多数细胞二氧化碳浓度在,410%,之间。,温度：,大多数人和哺乳动物细胞系在,36,至,37,下具有最佳生长状态。禽类细胞系在,38.5C,时具有最佳生长状态。虽然此类细胞也可在,37C,下培养，但其生长速度会变慢。,补充：,CO2,使用中的问题,CO2,钢瓶漏气问题；钢瓶的阀门关到最小和开到最大均不会漏气，只有开到中间大小才会漏气；,CO2,气压过大吹坏培养箱滤器问题；,上海减压阀门厂,樊瑞,YT12X-0.1L,￥,380,培养细胞的形态,定期检查培养细胞的形态,(,即：形状和外观,),，确认细胞健康状态，还要仔细观察培养的细胞以确定无污染；,细胞变质的征象包括：核周颗粒、胞质空泡、细胞隆起变圆或与基质分离等，这些变质征象可能为多种原因所致，例如：培养物污染、细胞系衰老或培养基中存在毒性物质，或者这些征象仅表明培养物需要更换培养基。变质严重时将会成为不可逆的变化（启动了细胞凋亡），因此换液和传代的频率要避免发生这些变化，因为这些变化很难逆转；,新加入工作的培养员要先看一下细胞系留存的细胞参考图片（以不同密度下拍摄），并且在以后的培养中经常比较，及时发现问题。,培养细胞的形态,根据形状和外观,(,即：形态,),可将培养的细胞分为三大类。,成纤维样细胞,：为双极或多极细胞，呈细长形，贴附在基质上生长。,上皮样细胞：,呈多角形，尺寸更为规则，贴附在基质上呈散在斑片状生长。,淋巴母细胞样细胞：,呈球形，通常悬浮生长，不贴附在基质表面。,神经元细胞有多种形状和大小，,I,型,(,有很长的轴突,),，,II,型,(,没有轴突,),。,成纤维样细胞,上皮样细胞,淋巴母细胞样细胞,换液,一旦培养开始就要定期为细胞更换培养基，即使不增殖的细胞也要更换；,换液的依据：,1.PH,降低，,PH,降低通常表示乳酸蓄积，乳酸是细胞代谢的副产物，具有细胞毒性，是细胞生长的不利因素。,培养基变橙色时需要换液，,如果培养基变成黄色，此时,PH,已达到,6.0,，细胞将会失去活性；,2.,细胞的密度和类型，每种细胞都有其适合的接种密度，且生长速度也不相同，有的细胞系甚至需要每天换液和传代，培养前一定要了解清楚；,3.,形态发生衰退，要做到对细胞形态很熟悉并且定期观察，细胞形态衰退不可逆，要避免发生。,换液步骤,观察培养基颜色，镜检观察细胞的密度以及是否有污染和衰退，决定是否换液；,以,70%,酒精擦拭培养瓶底；,打开培养瓶盖，用,5ml,移液器或蠕动泵吸出培养基；,加入预热的新鲜培养基，如果是不易贴壁的细胞（,293,），可以将培养瓶立起，将培养基加在细胞培养面的对侧，防止将细胞吹散；,盖好盖子，放回培养箱。,传代,细胞生长：延迟期、对数生长期、停滞期；,细胞进入对数生长晚期、接近汇合而未达到汇合状态时即应进行传代。正常细胞达到汇合状态时会脱离细胞周期并停止生长，进入停滞期,(,接触抑制,),，重新接种后需要较长时间才能恢复。转化细胞即使达到汇合状态也能继续增殖，但如不及时传代会开始衰退，并且增殖效率逐渐降低，最后逐渐死亡；,若细胞处于延滞期不要传代，脱离细胞周期的细胞需传代后继续培养恢复；,传代要注意接种密度，若到了适合的时间还没有汇合要增加接种密度，若很快彼此汇合要降低密度。原代前脂肪传代比率是,1:2,传代步骤,传代准备：,装有贴壁细胞的培养容器；,新的培养瓶、培养板或培养皿；,一次性无菌吸管、枪头等；,完全生长培养基，预热至,37,；,磷酸盐缓冲液（,PBS,），不含钙、镁和酚红，预热至,37,；,胰蛋白酶，预热至,37,；,细胞计数器；,传代步骤,吸出旧的培养基并丢弃；,用,PBS,冲洗细胞,(,每,10 cm2,培养表面积需要,2 mL,溶液，,25cm2,瓶加,5mlPBS),。从贴壁细胞层的对侧轻轻加入冲洗液，以避免搅动细胞层，轻摇容器；,吸出,PBS,并丢弃；,传代步骤,加入预热的胰蛋白酶，试剂量应足以覆盖细胞层,(,每,10 cm2,大约,0.5 mL),，轻轻摇晃容器，使胰蛋白酶完全覆盖细胞层；,将多余的胰酶吸出，将培养容器在,37,下孵育约,2 10,分钟，不同细胞系孵育时间有所差异；,在显微镜下观察细胞解离情况。如果解离程度未达,90%,，可将孵育时间延长几分钟，每,30,秒钟检查一次解离情况。也可轻轻拍打培养容器以加快细胞解离；,加入预定体积的新鲜培养基。吹打细胞层表面数次，使培养基分散。,细胞计数，将细胞悬液稀释到该细胞系推荐的接种密度；,将细胞重进接种到新的细胞培养瓶中，放回培养箱。,细胞的冻存,原理：缓慢冷冻，亲水的低温保护剂（,DMSO,、甘油）可使细胞内的水分离开细胞，在极低的温度下（液氮,-196,）保存细胞，快速复苏，减少细胞内晶体的形成,;,DMSO,：浓度范围,5%15%,，最佳,7.5%,10%,;,细胞密度较高似乎有利于提高存活率（,10,6,10,7,）；,以,1,/min,的速度冷冻存活率最高，程序降温盒；,冻存步骤,镜检细胞：外观健康、形态学特征、处于平台期前的对数生长晚期、没有污染；,用胰蛋白酶消化，加入培养基终止消化后离心，弃去培养基；,加入含有,10%DMSO,的冻存液，使细胞浓度为,10,6,10,7,；,将细胞悬液分装至标记好的冻存管中，拧紧盖子；,将冻存管放入程序降温盒中，置于,-80,过夜；,次日，将冻存管转移至液氮中保存并填写冻存记录，一周后从液氮中取出一只验证冻存效果，再次记录。,冻存细胞使用管理,新获得的细胞系应尽快冻存几只，称为,原始冻存,；,当细胞系大量繁殖成功应进行冻存，作为,种子储备,；,应保护好原始冻存和种子储备，绝不可分发使用,；,若使用或分发该细胞系，需要连续培养该细胞系并,分次冻存,，分次冻存可分发给其他使用者，使用者需要按需自己冻存，当使用者不在需要该细胞系时，应予以丢弃而不可传给他人使用；,当分次冻存将要用尽时，可从种子储备细胞进行补充，当种子储备低于,5,只时，可用原始冻存进行补充，要根据细胞使用的情况尽可能多的预留分次冻存细胞。,细胞转染基本知识,什么是转染？为什么要做转染实验？,细胞转染是指将外源分子如,DNA,，,RNA,等导入,真核细胞,的技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。在研究基因功能、基因表达与调控、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用越来越广泛。,转 染 技 术 的 分 类,常规转染技术分为两大类，一类是,瞬时转染,(transient transfection),，一类是,稳定转染,(stable transfection),。前者外源,DNA/RNA,不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒,DNA,转染效率较高，在转染后,24-72,小时内分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，,半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称永久转染，外源,DNA,既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（,episome,）存在。线性,DNA,比超螺旋,DNA,转入量低但整合率高。外源,DNA,整合到染色体中概率很小，大约,1/10000,的转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH,；新霉素抗性基因），潮霉素,B,磷酸转移酶（,HPH,），胸苷激酶（,TK,）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。,瞬 时 转 染,转染方法,原理,特点,磷酸钙,-DNA,共沉淀法,磷酸钙,DNA,复合物吸附细胞膜被细胞内吞,操作简便但重复性差，不适用于原代细胞,DEAE-,葡聚糖法,带正电的,DEAE-,葡聚糖与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞,相对简便、结果可重复，但对细胞有一定的毒副作用，转染时需除血清,电穿孔法,高脉冲电压破坏细胞膜电位，,DNA,通过膜上形成的小孔导入细胞,适用性广但细胞致死率高，,DNA,和细胞用量大，需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件,阳离子脂质体法（常用）,带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞,适用性广，转染效率高，重复性好，但转染效果随细胞类型变化较大,Biolistic,颗粒传递法,将,DNA,用显微重金属颗粒沉淀，再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞，,DNA,在胞内逐步释放并表达,可用于表皮细胞，成纤维细胞，淋巴细胞等,稳 定 转 染,转染方法,原理,特点,腺病毒法,通过侵染宿主细胞将外源,基因导入。,除了卵细胞以外，不会整合到宿主染色体中；除了抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞，能感染几乎所有的细胞类型。,慢病毒法,随机整合到宿主染色体，可能导致基因失活或激活癌基因，携带基因不能太大。,逆转录病毒法随机整合到宿主染色体，可能导致基因失活或激活癌基因，携带基因不能太大，细胞需处于分裂期。,慢病毒表达系统,腺病毒表达系统,逆转录病毒表达系统,病毒基因组,RNA,DNA,RNA,病毒原型,人免疫缺陷,I,型病毒,(HIV),人,5,型腺病毒,(Ad5),白血病病毒,(MMLV),载体系统,1,个表达质粒和,3,个包装质粒,1,个穿梭质粒和,1,个辅助质粒,1,个表达质粒,宿主细胞,分裂和非分裂的动物细胞,分裂和非分裂的动物细胞,分裂的动物细胞,是否整合,整合型,非整合型,整合型,表达丰度,高水平表达,高水平表达,高水平表达,表达时间,慢,(24,天,),快,(12,天,),快,(12,天,)克隆容量,不超过,6kb,的外源片段,高达,8kb,的外源片段,不超过,6kb,的外源片段,免疫原性,低,高,低,过表达,micro,RNA,特别适合,适合,不适合,RNAi,特别适合,适合,适合,病毒介导的稳定细胞株构建,感染目的细胞,抗生素筛选,建立单克隆细胞株,扩增单克隆细胞株,Western blot,检测,扩大培养,2-3,株,Western blot,检测,影响转染效率的因素有很多，细胞株本身的特性和活性，细胞培养条件，转染的,DNA,或,RNA,的质量，转染方法，转染试剂的选择等。,我们在实验中最常用的方法是脂质体转染，利用脂质体转染法最重要的就是减小脂质体的毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染时间的长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要因素，通过实验摸索的合适转染条件对于转染效率的提高有巨大的作用。,根据实际情况选择合适的转染方法,影 响 转 染 效 率 的 因 素,1,、转染试剂,2,、细胞状态,3,、细胞密度,4,、血清,5,、抗生素,6,、,DNA,质量,7,、载体构建,转 染 试 剂,不同细胞系转染效率通常不同，但细胞系的选择通常是根据实验的需要，因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。当然，最适合的是高效、低毒、方便、廉价的转染试剂。需要注意的是脂质体（如,Lipo2000,）最怕剧烈吹打，更不能震荡，那样脂质体会全部失效。,细 胞 状 态,一般低的细胞代数（,50,）能确保基因型不变。最适合转染的细胞是经过几次传代后达到,指数生长期的细胞,，细胞生长旺盛，,最容易转染,。细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，这会导致和转染相关的细胞行为发生变化，也就是说同一种系的细胞株，在各实验室不同培养条件下，其生物学性状发生不同程度的改变，导致其转染特性也发生变化。因此，如果发现转染效率降低，可以,尝试转染新鲜培养的细胞,以恢复最佳结果。,细 胞 密 度,不同的转染试剂，要求转染时的最适细胞密度各不相同，即使同一种试剂，也会因不同的细胞类型或应用而异。转染时过高或者过低的细胞密度会导致转染效率降低，以至表达水平偏低。因此，如果选用新的细胞系或者新的转染试剂，最好能够进行优化实验并为以后的实验建立一个稳定方法，包括适当的接种量和培养时间等。阳离子脂质体具有微量的细胞毒性而往往需要更高的铺板密度或者更多的悬浮细胞数，,有的要求细胞,90%,汇合（,Lipo2000,）；而有些非脂质体的配方则要求在,40%-80%,之间（,Fugene HD,），,总之是,尽量在细胞最适的生理状态下转染，以求最佳的转染效果,。不同的实验目的也会影响转染时的铺板密度，比如研究细胞周期相关基因等表达周期长的基因，就需要较低的铺板密度，所以需要选择能够在较低铺板密度下进行转染的试剂。,血 清,血清一度曾被认为会降低转染效率，老一代的转染方法往往要求转染前后洗细胞或者在无血清培养基条件下转染，但有些对此敏感的细胞如原代细胞会受到损伤，甚至死亡导致转染效率极低。不过转染产品配方几经革新后，对于主流的转染试剂来说，血清的存在已经不会影响转染效率，甚至还有助于提高转染效率，如阳离子聚合物等，血清的存在会影响,DNA-,转染复合物的形成，但,只要在,DNA-,转染复合物形成时用无血清培养基来稀释,DNA,和转染试剂就可以了,，,在转染过程中是可以使用血清的,，不过要特别注意：对于,RNA,转染，如何消除血清中潜在的,RNase,污染是值得关注的。通常的，血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物，对不同细胞的生长作用有很大的差别。血清质量的变化直接影响细胞生长，因此也会影响转染效率。新加培养基的预热对细胞转染也很有帮助。,抗 生 素,细胞培养过程中往往会添加抗生素来防止污染，但是这些添加剂可能对转染造成麻烦。比如青霉素和链霉素，就是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但有些转染试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这可能间接导致细胞死亡，造成转染效率低。目前主流的转染试剂全程都可以用含血清和抗生素等添加剂的完全培养基来操作，非常方便，省去了污染的麻烦。,D N A,质 量,DNA,质量对转染效率影响非常大。一般的转染技术（如脂质体等）基于电荷吸引原理，如果,DNA,不纯，带少量的盐离子、蛋白、代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行，但对,GenEscort,系列转染试剂影响不大。核酸纯化世界第一品牌德国,QIAGEN,公司提供的超纯质粒抽提试剂盒，能达到两倍,2CsCl,梯度离心以上的纯度效果，使我们不必为,DNA,质量操心。此外，对一些内毒素敏感的细胞（如原代细胞，悬浮细胞和造血细胞），,QIAGEN,还提供可去除内毒素污染的质粒抽提试剂盒，在质粒抽提过程中有效去除脂多糖分子，保证理想的转染效果。但如果使用,GenEscort,转染试剂，一般不需要这么高的,DNA,质量要求。当使用,GenEscort,转染试剂时，即使采用传统的酚,-,氯仿沉淀方法纯化质粒，仍然可达到非常好的转染效果，但所用的质粒量比试剂盒纯化方法的,DNA,用量大一些。,载 体 构 建,转染载体的构建（病毒载体，质粒,DNA,，,RNA,，,PCR,产物，寡核苷酸等）也影响转染结果。病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同病毒载体有其特定的宿主，有的还要求特定的细胞周期，如逆转录病毒需侵染分裂期的宿主细胞，此外还需考虑一些安全问题（如基因污染）。除载体构建外，载体的形态（超螺旋或线性,DNA,）及大小对转染效率也有不同的影响。如果基因产物对细胞有毒性作用，转染也很难进行。因此，选择组成型或可调控强度合适的启动子对转染的顺利进行也很重要。,主 流 转 染 试 剂 推 荐,转染试剂,特点,Lipo2000,（,Invitrogen,）,转染效率高但毒性高,X-tremeGENE 9,（,Roche,）,转染效率低但毒性低,Exfect Transfection,（,Vazyme,）,转染效率适中且毒性低,Attractene Transfection,（,Qiagen,）,转染效率适中且毒性低,GenEscort,（南京慧基）,转染效率适中且毒性低,