重组白细胞介素.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/2/9,#,简介,白细胞介素,-2,（,IL,2,）是由,Morgan,和,Ruscetti,发现的,由,T,细胞产生的一种淋巴因子，是一个分子质量为,14500,的糖蛋白。可使细胞毒性,T,细胞、自然杀伤细胞,(N K),和淋,巴因子激活的杀伤细胞,(LAK),增殖，并升高其杀伤活性，,进而清除体内肿瘤细胞和病毒感染细胞等。还可促进干扰,素、肿瘤坏死因子等细胞因子的分泌和抗体产生，是一种,免疫增强剂，具有抗病毒、抗肿瘤和增强机体免疫功能等,作用。,2025/12/15 周一,1,免疫作用机理：,IL-2,能与任何能形成,IL-2,受体的细胞,如辅助,性,T,细胞,(T H),、细胞毒性,T,细胞,(T e),、,B,细胞和自,然杀伤细胞结合,但结合的强度以,T c,细胞为最高。,IL-2,与相应受体结合后,细胞即从,G,相进入,S,相,并开始分化增殖。,2025/12/15 周一,2,临床应用,：,1.,肿瘤治疗：,在恶性肿瘤的发病机制中,肿瘤病人的白介素,-2,含量,较正常的水平低,不能使,NK,、,CT L,、,LAK,等杀伤细胞活化,和增殖,使肿瘤细胞逃逸，得不到清除。此时必须,提供外源,白介素,-2,帮助病人完成免疫监视功能,这就是白介素,-2,治疗,肿瘤的免疫学基础。,2025/12/15 周一,3,2.,抗病毒感染,3.,对感染性疾病的治疗作用,4.,对其他疾病的治疗：白介素,-2,在急性白血病、抗高,血压、抗寄生虫、免疫佐剂等方面都有着积极的应用。,2025/12/15 周一,4,IL-2,一,级,结,构,2025/12/15 周一,5,结构改造,IL-2,为螺旋状的长肽链，由,133,个氨基酸组成，其中,共有三个半胱氨酸（,cys),分别在第,58,、,105,、,125,位，其中,58,位与,105,位的,cys,生成的二硫键为活性所必需，且易错配,或生成二聚体，降低生物活性。基因工程重组,IL-2,用点突,变的方法把,125,位的,cys,改成,Ser,或,Ala,，使,IL-2,分子稳定性增,强。如果用点突变的方法把,58,或,105,位的,cys,变成其他氨基,酸，则,rIL-2,的活性几乎完全丧失。,2025/12/15 周一,6,改造后的优点,1.,提高白细胞介素,2,的,比活性,2.,提高白细胞介素,2,的,稳定性,：,由于野生型白细胞介素,2,分子中,125,位,cyt,是游离的，易,于与,58,或,105,位的,cyt,形成错配的二硫键，或分子间形成二,硫键而导致二聚体的形成，不利于白细胞介素,2,的稳定。,125,位丝氨酸型白细胞介素,2,则不存在二硫键错配问题。,2025/12/15 周一,7,3.,易于纯化：,在重组白细胞介素,2,的纯化过程中，白细胞介素,2,要被还原,剂还原为一级结构，然后再氧化为有活性的白细胞介素,2,。由,于,125,位,cyt,是游离的，易于与,58,或,105,位的,cyt,形成错配的二硫,键，或分子间形成二硫键而导致二聚体的形成。这些形成的异,构体和二聚体一方面会给纯化工作带来麻烦，另一方面比活性,降低。,125,位,cyt,被,ser,或,Ala,取代的,IL-2,则不纯在错配问题，因而,有利于,IL-2,的纯化。,4.,降低毒性：,125,位,cyt,被,ser,或,Ala,取代的,IL-2,由于比活性进一步提高，,在,给予同等活性的,IL-2,时，新型,IL-2,由于蛋白质的绝对数量较少而,可能具有较小的毒性，更容易被病人耐受，,从而有利于临床治,疗的进行。,2025/12/15 周一,8,化学修饰：,对蛋白进行化学修饰后可以,提高其抗酶消化的能力,延,长其在体内的作用时间,提高药效，降低或消除其在体内,的免疫原性。,对,IL-2,进行修饰的主要为,PEG,。,1992,年有人利用,N-,羟基丁二酰胺活化,PEG,修饰,r IL-2,作用时间提高,10,倍，而且免疫原性下降,抗肿瘤性能提高,毒副作用有所降低。,1994,年和,1997,年及其后都有人用,PEG,修饰,rIL-2,得到,生物活性基本不变而抗原性降低的修饰蛋白的报道,;,随后白,介素,-2,的化学修饰研究与其它蛋白的化学修饰一样成为了,研究的热点。,2025/12/15 周一,9,基因重组制备流程,IL-2 cDNA,文库的构建,利用探针杂交筛选,IL-2 cDNA,阳性克隆,与质粒载体,pBV220,连接，并转入大肠杆菌,DH5a,IL-2,基因表达,分离纯化包涵体,溶解，复性，纯化,纯化的,rIL-2,T,细胞,mRNA,反转录,cDNA,2025/12/15 周一,10,一种制备方法：,1.,构建工程菌,：将载有,IL-2,基因的质粒导入大肠杆菌细胞中，筛选出目的菌。,2.,挑单菌落,接种于装有,LB,培养基的摇瓶中，在,30,振荡培养,8-10,小时，然后转入含有合成培养基的发酵罐中，,30,下培养,11-13,小时，再在,42,下培养,5-6,小时，发酵后,收集菌体,。,3.,包涵体提取,：取菌体，用,PH8.5,，浓度为,50mMol Tris.Hcl-1mMol EDTA-1mMol DTT,缓冲液洗两遍，沉淀物再悬于同样缓冲液中，加溶菌酶，,4,下作用,30,分钟，冰浴超声至完全破裂为止，离心除去可溶性杂志，沉淀悬于,PH8.5,浓度为,50mMol Tris.Hcl-1mMol EDTA-2mMol DTT,。搅拌下缓慢滴加同体积,PH8.5,，浓度为,50mMol Tris.Hcl-1mMol EDTA-8mMol,尿素，室温下缓慢搅拌,20-40,分钟，离心除去可溶性杂志，沉淀再用缓冲液洗两遍，再将沉淀溶于,PH8.5,，浓度为,50mMol Tris.Hcl-10mMol DTT-7,至,8Mol GuHCL,溶解,1.5,小时后离心取上清在,4,保存。,2025/12/15 周一,11,4.,（,1,）,凝胶层析,：取上清装入,sephacrylus-200,中，用,PH8.5,，浓度为,50mMol Tris.Hcl-3,至,6Mol GuHcl,充分平衡后上样，平衡液洗脱，结果出现三个蛋白峰，收集第三峰，,4,保存；,（,2,）,复性,：取凝胶层析后样品，浓度为,50mMol Tris.Hcl,稀释三倍，加氧化和还原性谷胱甘肽，至,1mMol,和,5-10mMol,，调,PH,使为,7-9,，室温放置两小时，浓缩至,10,倍，过,sephadex G25,柱，用,PH3.0,，浓度为,0.1molGlyHcl,平衡并洗脱，收蛋白峰。,（,3,）,高效液相层析,：用,HPLC,仪进行纯化，用,0.1%,三氟乙酸平衡,Cl,反相柱后，泵入,rIL-2,样品，进行乙啨梯度洗脱，收集活性峰，低温减压下快速去除乙啨，即可,得到,rIL-2,纯品,。,2025/12/15 周一,12,药品名称,通用名：,注射用重组人白细胞介素,-2,英文名：,Recombinant Human Interleukin-2 for,Injection,主要组成成分：,重组人白细胞介素,-2,2025/12/15 周一,13,性状,本品为白色粉末状，易溶于水，溶解,后呈透明液体，无肉眼可见不溶物。,2025/12/15 周一,14,药代动力学,本品在体内主要分布于肾脏、肝脏、脾脏和肺。,肾脏是主要的代谢器官,，肾组织细胞的,组织蛋白酶,D,分解本品，在肾脏、血清中消除半衰期分别为,13,分和,85,分钟左右。,2025/12/15 周一,15,【,功效主治,】,用于治疗成人转移性肾细胞癌（,RCC,）及黑色素瘤等,恶性肿瘤,，也适用于癌性胸腹水的控制。,【,化学成分,】,主要成份：重组人白细胞介素,-2,、人血白蛋白。,2025/12/15 周一,16,【,药理作用,】,本品是一种淋巴因子，可使细胞毒性,T,细胞、自然杀伤细胞和淋巴,因子活化的杀伤细胞增殖，并使其杀伤活性增强，还可以促进淋巴细,胞分泌抗体和干扰素，具有抗病毒、抗肿瘤和增强机体免疫功能等作,用。在对动物的长期毒性试验中证明，无论血象、血尿生化检验、循,环系统检查、病理组织学检查，均无异常所见。,2025/12/15 周一,17,适用症,1,、用于肾细胞癌、黑色素瘤。乳腺癌、膀胱癌 肝癌、直肠癌、淋,巴癌、肺癌等,恶性肿瘤的治疗,，用于癌性胸腹水的控制，也可以用于,淋巴因子激活的杀伤细胞的培养。,2,、,用于手术、放疗及化疗后的肿瘤患者的治疗,，可增强机体免疫,功能。,3,、,用于先天或后天免疫缺陷症的治疗,，提高病人细胞免疫功能和,抗感染能力。,4,、,各种自身免疫病的治疗,：如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、,干燥综合征等,5,、,对某些病毒性、杆菌性疾病、胞内寄生菌感染性疾病,：如乙型,肝炎、麻风病、肺结核、白色念珠菌感染等具有一定的治疗作用。,2025/12/15 周一,18,用法用量,本品应在临床医师指导下使用。,1.,静脉滴注,：一次用本品,10,万一,80,万国际单位,(IU),加入到,50ml,氯化钠注射液中，静脉滴注,2,3,小时，一日,1,次，,4,6,周为,一疗程。,2.,皮下注射,：一次用本品,50,万,100,万国际单位,(IU),用,2ml,氯,化钠注射液溶解，皮下注射，一周,2,3,次，,6,周为一疗程。,3.,胸腹腔注射,：一次用本品,30,万,l00,万国际单位,(IU),用,20ml,氯化钠注射液溶解，胸腔或腹腔注射，尽量抽出腔内积液后注,入，一周,1,2,次，,2,4,周,(,或积液消失,),为一疗程。,4.,介入动脉灌注,：一次用本品,40,万,l00,万国际单位,(IU),，用,100ml-250l,氯化钠注射液溶解，二周,1,次，,6,周为一疗程。,5.,肿瘤灶局部给药,：根据瘤体大小决定用药剂量。一般剂量,为一次,20,万国际单位,(IU),，一周连用,4,次，,2-4,周为一疗程。,2025/12/15 周一,19,【,不良反应,】,1,各种不良反应中最常见的是,发热、寒战,，而且与用药剂量有关，一般,是一过性发热（,38,左右），亦可有寒战高热，停药后,3,4,小时体温,多可自行恢复到正常。个别患者可出现恶心、呕吐、类感冒症状。,2,皮下注射者局部可出现,红肿、硬结、疼痛,，所有副反应停药后均可自,行恢复。,3,使用较大剂量时，本品可能会引起,毛细血管渗漏综合征,，表现为低,血压、末梢水肿、暂时性肾功能不全等。使用本品应严格掌握安全量，,出现上述反应可对症治疗。,2025/12/15 周一,20,【,禁忌症,】,1,对本品成份有过敏史的病人。,2,高热、严重心脏病、低血压者，严重心肾功能不全者，肺功能异常,或进行过器官移植者。,3,重组人白细胞介素,-2,即往用药史中出现过与之相关的毒性反应：,（,1,）,持续性室性心动过速；,（,2,）,未控制的心率失常；,（,3,）,胸痛并伴有心电图改变、心绞痛或心肌梗塞；,（,4,）,心压塞；,（,5,）,肾功能衰竭需透析,72,小时；,（,6,）,昏迷或中毒性精神病,48,小时；,（,7,）,顽固性或难治性癫痫；,（,8,）,肠局部缺血或穿孔；,（,9,）,消化道出血需外科手术；,（,10,）,孕妇慎用。,2025/12/15 周一,21,参考文献,1.,徐月美 中国医药工业杂志,1992,2.,李伟 生物技术,1997,3.,新型重组人白细胞介素,2,的制备方法及其表达载体和工程菌 中华,人民共和国国家知识产权局,1999,4.,重组人白细胞介素制备工艺 中华人民共和国国家知识产权局,1993,5.,重组人白细胞介素制备工艺 中华人民共和国国家知识产权局,1994,6.,重组白细胞介素,-,2(In te r le u k in,-,2),在临床的应用和展望 广州医学院学报,1998,7.,白介素,-2,研究进展 海峡药学,2006,8.,白细胞介素一,2,工程菌高效表达影响因素的初探 中国医药工业杂,志,1996,9.,基因工程白介素,2,的纯化研究 中国免疫学杂志,1990,2025/12/15 周一,22,2025/12/15 周一,23,谢谢,!,