药品微生物检验基础知识.ppt

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aureus)是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属有“嗜肉菌的别称，是革兰氏阳性菌的代表，可引起很多严峻感染。,2金黄色葡萄球菌,典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径m左右，显微镜下排列成葡萄串状。,3,枯草芽孢杆菌,枯草芽胞杆菌，是芽胞杆菌属的一种。单个细胞0.823微米，着色匀整。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢微米，椭圆到柱状，位于菌体中心或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落外表粗糙不透亮，污白色或微黄色，在液体培育基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。,4,生孢梭菌,生孢梭菌（,Clostridiumsporogenes,）又译产孢梭菌，能够产生孢子，革兰氏染色阳性，以周生鞭运动，严格厌氧的梭菌。,5,铜绿假单胞菌,铜绿假单胞菌的学名是Pseudomonas aeruginosa，绿脓假单胞菌属为革兰染色阴性需氧菌，存在于土壤、尘埃、水和少数人体肠道中，亦可短暂寄生于皮肤，主要寄生在肛门、生殖器部位、腋窝和外耳道等处。在正常状况下一般不致病，当机体反抗力低下时可致病，还可引起病人死亡。,细菌鉴别革兰氏染色,格兰仕阳性菌例如：金黄色葡萄球菌，也称“金葡菌”，细胞壁含,90%,的肽聚糖和,10%,的磷壁酸。其肽聚糖的网状结构比革兰氏阴性菌致密，染色时结晶紫附着后不被酒精脱色故而呈现,紫色,革兰氏阴性菌例如,:,大肠埃希菌的细胞壁肽聚糖层薄、交联度差，脂类含量高，所以紫色复合物被酒精冲掉然后附着了,沙黄的红色,。,革兰氏染色,革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：,1）涂片固定。,2）草酸铵结晶紫染1分钟。,3）自来水冲洗。,4）加碘液覆盖涂面染约1分钟。,5）水洗，用吸水纸吸去水分。,6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。,7）蕃红染色液（稀）染1分钟后，自来水冲洗。枯燥，镜检。,染色结果,革兰氏阳性菌呈蓝紫色,，,革兰氏阴性菌呈红色,。,染色结果,革兰氏阳性菌呈蓝紫色,，,革兰氏阴性菌呈红色,一、微生物基本介绍,真菌（包括酵母菌和霉菌）,1,黑曲霉菌,2,白色念珠菌,1,黑曲霉菌,黑曲霉，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。,2,白色念珠菌,白色念珠菌沙氏葡萄糖琼脂白色念珠菌,白色念珠菌（,Monilia albican,或,canidia Albicans,），,是一种真菌，通常存在于正常人口腔，上呼吸道，肠道及阴道，是医学全身性真菌感染病的重要途径，可以引起心膜炎、肺炎、尿布疹、鹅口疮、阴道炎、脑膜炎、及败血症。,白色念珠菌,右图：白色念珠菌在该批念珠菌显色比照培育基外表培育 48 小时的生长形态。,左图：白色念珠菌在该批念珠菌显色比照培育基外表培育 24 小时的生长形态；,一、微生物基本介绍,5、微生物与我们,每张人民币带细菌：900万个；,人体体表及体内存在大量的微生物；,皮肤外表：平均10万个细菌/平方厘米；,口腔“细菌种类超过500种；,肠道：微生物总量达100万亿；,（未清洗的手）,（,清洗过,的手）,一、微生物基本介绍,二、培育基,1、培育基的制备,培育基的配制：,按处方配制，运用按处方生产的符合规定的脱水培育基,二、培育基,配制时留意：,不得运用结块或颜色发生变更的脱水培育基；,常用的溶剂是纯化水、蒸馏水，避开运用自来水，因其中含有氯等抗菌物质；,脱水型培育基应完全溶解于水中，再分装灭菌；,加热助溶，留意不要过度加热；,如须要添加其它组分，加入后应充分混匀；,配制用的容器最好用中性玻璃或聚乙烯容器；,配制培育基一般要在1小时内完成，假如室温高，配制时间过长，易使培育基受污染；,二、培育基,2、培育基的灭菌,已配制好的培育基最好尽快灭菌；,一般培育基接受湿热灭菌，即高压蒸汽菌，通常是12115分钟；,湿热灭菌必需严格限制灭菌温度和时间，不行重复高温灭菌；,高压蒸汽灭菌锅在运用时，内置物品不能太多，不要积累形成死角。,要定期对压力表等进行检定，检定周期一般为半年；,定期对灭菌效果进行检验，可接受生物指示菌法、化学变色纸片（如湿热灭菌指示条）等进行验证。,二、培育基,3、培育基的贮藏,贮藏留意：,灭菌后的培育基应快速取出，避开长时间保存在灭菌锅内，造成过度灭菌；,培育基保存前应标上名称和制备日期（或到期日期）；,琼脂培育基不得在0或0以下存放；,琼脂平板最好现配现用，如置冰箱保存，在验证的期限内运用；,药典规定3周内运用，有密封装置的培育基可以保存一年,二、培育基,4、培育的再溶化方式,水浴加热,微波炉,电热炉加热,留意：,固体培育基灭菌后的再溶化只允许一次,溶化的培育基应置于4550的水浴中，不得超过8小时,二、培育基,5、培育基的性能评估,全部购回的、配制好的培育基均应进行质量限制试验（培育基适应性检查）,理化指标（P55）,微生物学指标（P55）,购置的成品培育基配方与药典配方核对,中检院购置的比照培育基,三、,菌种,1,、分类（概念）：,标,准,菌,株,由国内或国际菌种保藏机构保藏的,标准储备菌株,由标准菌株经一次传代得到的培养物,商业派生菌株,由供应商提供的所有特性与标准菌株等效的菌株,工,作,菌,株,由标准储备菌株以传代得到的培养物,三、,菌种,留意：,标准储藏菌株、工作菌株都应进行纯度和特性确认,工作菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏机构获得的标准菌株为第0代）,“1代”是指将活的培育物接种到微生物生长的簇新培育基中培育。,试验室必需建立和保存其全部菌种的进出、收集、贮藏、保存、确认试验及销毁的记录。,三、,菌种,标准菌株：,冻干粉（图,P63,）,甘油冻存管（图,P64,）,三、,菌种,菌种保藏机构：,CMCC 中国医学微生物菌种保藏管理中心,GIMCC 广东省微生物探讨所微生物菌种保藏中心,ATCC 美国典型菌种保藏中心,例：CMCC（B）26003,菌种保藏机构 细菌 菌种编号（金黄葡萄球菌）,三、,菌种,2、菌种的鉴定,金黄色葡萄菌 CMCC(B)26003,甘露醇平板上划线分纯，典型菌落,为黄色圆形突起，外表潮湿光滑；,革兰氏染色：阳性，球菌。,血浆凝固霉酶试验：阳性,三、,菌种,2、菌种的鉴定,大肠埃希菌 CMCC(B)44102,大肠埃希菌在麦康凯培育基上的菌落形态特征：鲜桃红色或微红色,菌落中心呈深桃红色,圆形,扁平,边缘整齐,外表光滑,潮湿,革兰氏染色：阴性，杆菌。,大肠埃希菌,(Escherichia coli),供试液制备和增菌培育 取供试品，照“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”（通则1105）制成1：10 供试液。取相当于1g 或1mL 供试品的供试液，接种至适宜体积（经方法适用性试验确定的）的胰酪大豆胨液体培育基中，混匀，3035培育1824 小时。,大肠埃希菌,(Escherichia coli),选择和分别培育取上述预培育物1mL 接种至100mL 麦康凯液体培育基中，4244培育2448 小时。取麦康凯液体培育物划线接种于麦康凯琼脂培育基平板上，3035培育1872 小时。,大肠埃希菌,(Escherichia coli),结果推断若麦康凯琼脂培育基平板上有菌落生长，应进行分别、纯化及适宜的鉴定试验,确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培育基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。,三、,菌种,铜绿假单胞菌 CMCC(B)10104,溴化十六烷基三甲铵琼脂平板上划线分纯，典型菌落呈扁平，无定形、周边扩散，外表湿灰白色，四周有蓝绿色素扩散。,氧化酶试验：阳性,绿脓菌素：阳性,革兰氏染色：阴性，杆菌；,三、,菌种,白色念珠菌 CMCC(B)98001,沙氏葡萄糖琼脂平板上划线分纯，典型菌落乳白色，外表光滑有浓酵母气味。,革兰氏染色：阳性，菌体大，球菌。,芽管试验：阳性,三、,菌种,3、菌种的保藏,A：甘油冷冻管保藏法,保藏温度：3080；保藏菌种有效期：12年,优点：保存期较长，反复传代导致菌种变异的风险较小；,缺点：操作相对困难，本钱较高。,B：斜面低温保藏法,保藏温度4左右，保藏时间13个月，但铜绿假单胞菌不宜用本法保存。,优点：操作简便，本钱低，比较简洁驾驭；,缺点：保存期比较短，反复传代有引起变异的可能。,保藏温度,保藏,有效期,优点,缺点,甘油冷冻管,保藏法,-30,80,12年,保存期较长，,反复传代导致菌种变异的风险较小,操作相对复杂，,成本较高,斜面低温,保藏法,4,左右,13个月,操作简便，,成本低，,比较容易掌握,保存期比较短，,反复传代有引 起变异的可能；,铜绿假单胞菌不宜用本法保存。,甘油冷冻管保存菌种,甘油冷冻管保存菌种,甘油冷冻柜保存菌种,三、,菌种,4、菌种的运用和销毁,过期菌种应刚好销毁，销毁时应经12130分钟的生物灭活处理。,12145min高温蒸汽灭活。并进行菌种销毁记录。,四、微生物限度检查法,1、定义,微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。,2、检查工程,定量检查细菌数、霉菌及酵母菌数,定性检查限制菌（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念球菌）,检验环境：与无菌检查相同,四、微生物限度检查法,3、检验量,指一次检验用量；10g或10ml，膜剂为100cm2，珍贵药品、微量包装药品的检验量可以酌减。,4、供试液的制备,依据供试品的理化特性与生物特性，实行适宜的方法制备供试液；,供试液制备若需加温时，应匀整加热，且温度不超过45。,四、微生物限度检查法,制备原则：,简便、快速！,供试液从制备至加入检验用培育基，不得超过1小时。,四、微生物限度检查法,供试品分类,液体供试品,固体、半固体或黏稠性供试品,需用特殊供试液制备方法的供试品,非水溶性供试品,膜剂供试品,肠溶及结肠制剂供试品,气雾剂、喷雾剂供试品,贴膏剂供试品,具抑菌活性的供试品：培育基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法,四、微生物限度检查法,5、方法验证,验证菌株,大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉,计数方法的验证,当建立产品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所接受的方法适合于该产品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。,若产品的组分或原检验条件发生变更可影响检验结果时，计数方法应重新验证。,四、微生物限度检查法,试验组,薄膜过滤法计数时：取规定量的供试液，过滤，冲洗，在最终一次的冲洗液中加入50100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。,菌液组,测定所加的试验菌数（50100cfu）,供试品比照组,取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数,稀释比照组,用相应的稀释液替代供试品，加入50100cfu试验菌，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。,四、微生物限度检查法,验证方法：,验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算试验菌每次试验的回收率不低于70%，若任一次试验中试验组的菌回收低于70%，应实行适宜的方法消退供试品的抑菌活性，并重新进行进行方法验证。,四、微生物限度检查法,限制菌检查法验证,当建立药品的微生物限度检查法时，应进行限制菌检查方法的验证，以确认所接受的方法适合于该药品的限制菌检查。,接受薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌（10100cfu）应加在最终一次冲洗液中，依法操作。,若上述试验检出试验菌，按此供试液制备法和限制菌检查法进行供试品的该限制菌检查；,若试验组未检出试验菌，应接受相应方法消退供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。,四微生物限度检查法,细菌、霉菌及酵母菌检查,检查方法：平皿法和薄膜过滤法,按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数检查,四、微生物限度检查法,菌落报告规则：,细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于,300cfu,；,霉菌宜选取平均菌落小于,100cfu,的稀释级，作为菌数报告（即两位有效数字）的依据。,如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落，但平均菌落数小于,1,时，以,1,乘以最低稀释倍数的值报告菌数。,四、微生物限度检查法,菌落报告规则示例,各稀释级（供试液,1ml/皿）平均菌落计数（cfu）,菌数报告数,（,cfu/ml.g）,原液,1：10,（-1）,1：10,2,（,-2）,1：10,3,（,-3）,1,64,8,2,640,2,420,64,8,6400,3,不可计,420,64,64000,4,0,0.5,0,100,5,0,0,100,6,0,0,0,10,7,0,0,0,1,例：菌数报告规则表,1,四、微生物限度检查法,薄膜过滤法,滤膜孔径不大于m，直径一般为50mm，若须要用冲洗液冲洗滤膜，总冲洗量不得超过1000ml。每张滤膜每次冲洗量不超过100ml。,贴膜 菌面朝上于相应的琼脂培育基平板上培育，每种培育基至少制备一张滤膜。,阴性比照试验（不得有菌生长）,菌落报告规则 每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu，若滤膜上无菌生长，以1乘以稀释倍数的值报告菌数。,四、微生物限度检查法,限制菌检查,供试品的限制菌检查应按已验证的方法进行，增菌培育基的实际用量同限制菌检查方法的验证。,阳性比照试验：加菌量为10100cfu，阳性比照试验应检出相应的限制菌。,阴性比照试验：取稀释液10ml代替供试液，阴性比照应无菌生长。,依据不同的给药途径，必检的限制菌不同。,四、微生物限度检查法,不同给药途径制剂应检限制菌汇总,药品给药途径,应检控制菌,说明,局部给药制剂,金黄色葡萄球菌,所有制剂,铜绿假单胞菌,白色念珠菌,阴道,（尿道）给药,口服制剂,大肠埃希菌,所有品种,大肠菌群,含中药原药粉、,沙门菌,含动物组织（提取物）,给药,多途径给药制剂,同时检查各给药途径应检的控制菌,四、微生物限度检查法,微生物限度检查法结果推断,供试品检出限制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试；,供试品的细菌数、霉菌及酵母菌数其中任何一项不符合该品种项下的规定，应从同一批样品中随机抽样，独立复试两次，以3次结果的平均值报告菌数；,若供试品的细菌数、霉菌及酵母菌数、限制菌三项检验结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定，反之判供试品不符合规定。,感谢大家！,结 语,