第五章--诊断酶学(自编).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第 五 章,诊 断 酶,学,第一节 概 述,通过本节学习，掌握的知识点,1、酶的组成、结构及功能特点。,2、酶的催化机制。,3、什么是同工酶，LDH、CK等同工酶的分布及临床意义。,4、何谓工具酶，工具酶参与的指示反应。,5、终点法和动力学法测定代谢物浓度的原理及区别。,第一节 概 述,一、酶的概念与特征,（一）、酶的概念：,酶是活细胞分泌产生的具有催化活性的,蛋白质或RNA。,第一节 概 述,（二）酶的组成及功能,按照酶的分子组成：,单纯酶：,酶蛋白,结合酶：金属离子,辅助因子,小分子有机化合物,第一节 概 述,（三）、酶的催化作用机制,1、酶的活性中心：,酶分子中能和底物特异性结合并将底物,转化为产物的区域称为酶的活性中心。,第一节 概 述,2、诱导契合学说,在酶促反应中，酶与底物结合时，底物,首先和酶分子上的活性中心相结合，形成酶-,底物中间复合物（ES）。在构象上相互诱,导，致使活性中心与底物完全紧密结合，这,一过程称为诱导契合学说。,第一节 概 述,（四）酶促反应动力学,1、底物浓度对酶促反应速度的影响,2、酶的浓度对酶促反应速度的影响,3、温度、PH、激活剂和抑制剂对酶促反应,速度的影响。,第一节 概 述,二、同工酶的概念与特征,1、概念,指催化相同的化学反应，但酶蛋白的分,子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一,组酶。,第一节 概 述,二、同工酶的概念与特征,3、临床常见的同工酶,（1）LDH：,该酶是四聚体酶，由两种亚基类型即骨骼肌型（M）和心肌型（H）。,种类：LDH1，LDH2，LDH3,LDH4，LDH5。主要分布于心肌，红细胞，骨骼肌和肝脏中。,第一节 概 述,二、同工酶的概念与特征,3、临床常见的同工酶,（2）CK肌酸激酶,该酶是二聚体酶，有两种亚基类型即骨骼肌型（M）和脑型（B）。,该酶有三种：CK1 脑中,CK2 心肌,CK3 骨骼肌,第一节 概 述,二、同工酶的概念与特征,3、人体重要的同工酶,（2）CK肌酸激酶,CK,肌酸 +ATP 磷酸肌酸 +ADP,血清中CK2的活性测定有助于心肌梗死的早,期诊断。,第一节 概 述,三、工具酶,（一）定义：,酶学分析中作为试剂用于测定化合物浓,度或酶活性浓度的酶称为 工具酶,。,第一节 概 述,三、工具酶,（二）工具酶参与的指示反应,1、利用特异性较高的氧化酶产生过氧化氢，再通过加氧化发色剂进行比色的方法,第一节 概 述,三、工具酶,（二）工具酶参与的指示反应,例：,多胺氧化酶,多胺 氨基酸 +H,2,O,2,+NH,3,+,H,2,O,2,和4-AAP（氨基安替比林）显色反应。,第一节 概 述,三、工具酶,（二）工具酶参与的指示反应,2、NAD（P）H在340nm具有特征性光吸收，NAD（P）+在340nm处不具有特征性光吸收，利用氧化-还原酶反应使其连接到NAD（P）+/NAD（P）H正/逆反应中，通过该两种物质量的变化间接反应待测酶的活性。,第一节 概 述,三、工具酶,（二）工具酶参与的指示反应,例：,己糖激酶法测定血清中葡萄糖浓度,己糖激酶,葡萄糖 +ATP 6-磷酸葡萄糖 +ADP,6-磷酸葡萄糖脱氢酶,6-磷酸葡萄糖 6-磷酸葡萄糖酸,NADP,+,NADPH +H,+,第一节 概 述,三、工具酶,（三）酶循环法,1、定义：,采用两类工具酶进行循环催化反应，使被测物放大扩增，从而提高检测灵敏度。,第一节 概 述,三、工具酶,（三）酶循环法,2、实例：酶循环法测定总胆汁酸,第一节 概 述,三、工具酶,（三）酶循环法,2、实例：酶循环法测定总胆汁酸,解释,：硫代-NADH在405nm处有强值，胆汁酸的浓度与此处吸光值的变化成正比。,A/min（样品）,总胆汁酸浓度=,A/min（标准品）,第一节 概 述,三、工具酶,（三）酶循环法,3、优势：,（1）特异性好,（2）反应温和，无污染。,（3）灵敏度高,第一节 概 述,三、工具酶,（四）代谢物浓度的酶法测定技术,1、终点法（end-point assay）,（1）定义：在代谢物酶促反应中，随着时间的延长，待测物浓度逐渐减少而产物逐渐增多，一定时间后反应趋于平衡，测定反应达到平衡后待测物（底物）或产物的变化总量。,第一节 概 述,三、工具酶,（四）代谢物浓度的酶法测定技术,1、终点法（end-point assay）,（2）终点法测定的基本条件：,待测物浓度S应远远小于其米氏常数Km，此时任何时刻的反应速率,V=VmaxS/Km,反应配方中所用的酶量(V)应足够大，而Km应小，以保证有较快的反应速度完成测定。,第一节 概 述,三、工具酶,（四）代谢物浓度的酶法测定技术,1、终点法（end-point assay）,（3）种类,直接法：,待测物和产物在理化性质上有可直接进行检测的差异，可以直接测定待测物或产物本身信号的改变来进行定量分析。,第一节 概 述,三、工具酶,（四）代谢物浓度的酶法测定技术,1、终点法（end-point assay）,（3）种类,酶偶联法：,如果酶促反应的底物或产物无可直接检测的成分，则可将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中而达到的检测目的。,第一节 概 述,酶偶联法：,E,X,E,i,A B C,Ex：为辅助酶,E,i,：为指示酶,C：被检测的物质,第一节 概 述,酶偶联法（实际例子）：,血浆葡萄糖测定的氧化酶法（GOD）,葡萄糖氧化酶,葡萄糖+水+氧 葡萄糖酸+H,2,O,2,过氧化物酶,4-氨基安替比林+酚+H,2,O,2,红色醌类化合物+水+氧,色原性氧受体,第一节 概 述,三、工具酶,（四）代谢物浓度的酶法测定技术,1、终点法（end-point assay）,（4）终点法实验设计的考虑因素,工具酶的特异性 高特异性,Km大小合适：在保证测定线性的前提下，Km值要尽量小。,第一节 概 述,三、工具酶,（四）代谢物浓度的酶法测定技术,1、终点法（end-point assay）,（4）终点法实验设计的考虑因素,酶的用量：酶的用量足够大，保证反应在较短的时间内完成。,工具酶中的杂酶应低于允许限制。,反应平衡点：保证反应朝正反应方向进行,附加剂：反应中添加的附加剂不抑制酶的活性，不影响试剂稳定性，不与底物或反应液中的物质发生作用。,第一节 概 述,三、工具酶,（四）代谢物浓度的酶法测定技术,2、动力学法（定时法）：,（1）定义：根据固定时间内底物消耗量和产物生成量计算酶的活性。,（2）原理：当酶促反应为一级反应时，反应速度V=KS。此时测定酶促反应的初速度，根据标准浓度法即可求得待测物的浓度。,第一节 概 述,三、工具酶,（四）代谢物浓度的酶法测定技术,2、动力学法（定时法）：,（3）条件：实际操作中在底物浓度消耗小于5%时即可采用该方法。,第 二 节 酶测定技术,通过本节的学习掌握如下知识：,1、血清酶活性浓度测定技术有哪些？,2、酶活性浓度定量系数K值的计算与实验室的应用。,3、临床酶学测定的标准化要求和临床意义。,4、酶活性浓度单位？目前通用的酶单位的表示方法有哪些？,5、酶质量免疫化学测定法的原理和优缺点,6、同工酶分析方法及原理,第 二 节 酶测定技术,定时法,酶活性测定,连续监测法,酶学测定方法,酶质量测定：免疫酶法,第 二 节 酶测定技术,一、酶活性测定,（一）定时法测定酶活性（动力学法）,1、定义,在足量底物系统中，加入一定量的酶试剂，反应一定时间后，加入,终止试剂终止反应,，然后测定该段时间内底物消耗量或产物的生成量计算酶的活性。,第 二 节 酶测定技术,一、酶活性测定,（一）定时法测定酶活性（动力学法）,2、定时法计算酶活性,假设某一样品的酶活性为X（U/L），取,样品Vs（ml）与底物缓冲液Vr（ml）孵育，,经反应后，加入终止液Ve（ml），检测到产,物净吸光度增加为A，该产物的摩尔消光系数,，比色杯光径为b（cm第 二 节 酶测定技术,一、酶活性测定,（一）定时法测定酶活性（动力学法）,2、定时法计算酶活性,定时法中可能引起的误差,3、消除误差方法：,做预实验找出酶促反应速率恒定,的时期，确定线性时间，然后在该,段时间内测定。,第 二 节 酶测定技术,（二）、连续监测法测定酶活性（终点法）,1、定义：,连续监测法是将酶和底物在特定的条件下孵育，,每隔一定时间（2-60s）连续,测定酶促反应过程中某一底物或产物的特征信号的变化，从而计算出每分钟的信号变化速率。,第 二 节 酶测定技术,第 二 节 酶测定技术,3、分类,（1）、直接法,直接通过测定反应体系中底物或产物,理化特性的变化，从而计算出酶活性浓度。,第 二 节 酶测定技术,（2）、间接法 酶偶联反应,Ex Ei,A B C,Ex Ea Ei,A B C D,Ex：待测酶 Ea：辅助酶 Ei：指示酶,第 二 节 酶测定技术,采用酶偶联法测定酶活性前提：,延滞期越短越好,第 二 节 酶测定技术,采用酶偶联法测定酶活性前提：,指示酶量的选择标准,Vx/（Km）x=Vi/（Km）i,Vx：测定酶的测定上限,（Km）x（Km）i是测定酶和指示酶的Km值。,第 二 节 酶测定技术,采用酶偶联法测定酶活性前提：,指示酶量的选择标准,米-曼氏方程,Vx=,Vi=Vx 1+,ViP,P+（Km）i,（Km）i,P,第 二 节 酶测定技术,采用酶偶联法测定酶活性前提：,指示酶量的选择标准,第 二 节 酶测定技术,（三）干扰因素,1、其他酶和物质的干扰,2、酶的污染,3、非酶反应,4、分析容器的污染,5、沉淀形成,第 二 节 酶测定技术,（四）血清酶活性浓度测定条件的优化,1、方法的选择,2、仪器和设备,3、试剂,4、自动生化分析仪参数的设置,第 二 节 酶测定技术,（五）分析前因素对酶活性测定的干扰,1、溶血,2、抗凝剂,3、标本的储存温度,第 二 节 酶测定技术,（六）酶活性浓度的单位,1、酶活性单位,（1）惯用单位,（2）国际单位,定义,：在特定的条件下，一分钟内使底物转变1,mol的酶量为一个国际单位，以IU表示。1IU=1mol/min,第 二 节 酶测定技术,（六）酶活性浓度的单位,（3）Katal单位：,定义,：在规定条件下，每秒内催化转化,1mol底物的酶量。1Katal=1mol/s,Katal是我国法定的酶活性单位，常用单位,一般为,Katal或nKatal。,1Katal=60,10,6,U,IU=1,mol/min=16.67nmol/s=16.67nKatal,第 二 节 酶测定技术,（六）酶活性浓度的单位,2、酶活性浓度单位,（临床上，酶活性浓度以每单位体积所含的酶活性单位数表示）,（1）表示方法：目前我国各级临床中表示酶浓度的方法是U/L。,1U/L=16.67nKatal/L,第 二 节 酶测定技术,（六）酶活性浓度的单位,2、酶活性浓度单位的计算,U/L=,A,V10,6,min,VL,说明：V：反应体系体积（ml）,：摩尔吸光系数（cm,2,/mol）,v：样品量（ml）L：比色杯光径（cm),A：吸光度变化 10,6,：将mol换算成,mol,摩尔吸光系数的定义为：在特定的条件下，一定波长的光，光径为1.00cm时，通过所含吸光物质的浓度为1.00mol/L的吸光度,第 二 节 酶测定技术,（六）酶活性浓度的单位,3、参考区间和正常上限的倍数应用,（1）参考区间,第 二 节 酶测定技术,（六）酶活性浓度的单位,3、参考区间和正常上限的倍数应用,（2）正常上限倍数的应用,正常上限upper limits of normal,ULN）,第 二 节 酶测定技术,（七）系数K值的计算与应用,1、K：酶活性 浓度定量系数，主要用于临床酶,活性测定的计算与校准。,U/L=,K,K=,例：,NADH的,为6.22,10,3,cm/mol，血清量50,m，底物溶液为1ml。比色杯光径为1cm，则K=1.05,10,6,/（6.22,10,3,0.05,1,）=3376,A,min,V10,6,VL,第 二 节 酶测定技术,（七）系数K值的计算与应用,2、K的意义与设置,K的设置应该考虑测定酶的参考范围上限及测定的时间两个方面。,过高：测定的线性范围宽，但是重复性差,过低：线性范围窄，但是精密度好,第 二 节 酶测定技术,（八）临床酶学测定的标准化,1、标准化途径,（1）使用推荐方法和参考方法,（2）使用公认的酶校准物或酶参考物,第 二 节 酶测定技术,（八）临床酶学测定的标准化,2、酶活性浓度测定的参考系统,（1）建立原级参考方法,（2）制备原级参考物,（3）建立参考实验室网络,第 二 节 酶测定技术,二、酶质量测定,（一）免疫化学法测定酶质量的原理,1、放射免疫测定（RIA）,将放射性核素标记的酶分子与相应的抗体,作用产生沉淀，再将沉淀分离进行定量测定。,例：,用RIA检测尿中五项蛋白：2-,MG,、,IgG,、Alb、THP、1-MG 诊断早起肾病。,第 二 节 酶测定技术,二、酶质量测定,（一）免疫化学法测定酶质量的原理,2、其它方法：,（1）免疫抑制法,常用于同工酶的测定。,例如：CK-M抗体检测CK-MB的活性。,第 二 节 酶测定技术,二、酶质量测定,（一）免疫化学法测定酶质量的原理,2、其它方法：,（2）化学发光免疫测定（CLIA）,将高灵敏度的化学发光测定技术与免疫,法相结合的一项技术。,第 二 节 酶测定技术,二、酶质量测定,（一）免疫化学法测定酶质量的原理,2、其它方法：,（3）酶免疫测定（EIA）,将酶催化作用的高效性与抗原抗体反应的,特异性结合的一种微量分析技术。,酶联免疫吸附实验（ELISA）,酶免疫组化技术,第 二 节 酶测定技术,二、酶质量测定,（一）免疫化学法测定酶质量的原理,2、其它方法：,（4）荧光免疫测定（FEIA）,是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪技术相结合的测定方法。,标记物：荧光素,第 二 节 酶测定技术,二、酶质量测定,（二）酶质量免疫化学测定法的优点,1、灵敏度高,2、特异性高,3、能用于测定一些无活性的酶蛋白,4、应用于同工酶的测定,第 二 节 酶测定技术,二、酶质量测定,（三）免疫化学测定法的局限性,1、制备足够量的提纯酶做为抗原或制备具有,免疫化学性质的抗血清比较困难。,2、测定繁琐,3、测定成本高,第 二 节 酶测定技术,三、同工酶的检测,第 二 节 酶测定技术,三、同工酶的检测一）电泳法,1、常用方法：醋酸纤维薄膜电泳（CAE）、,琼脂糖凝胶电泳（AGE），聚丙烯酰胺凝胶,电泳（PAGE）等。,第 二 节 酶测定技术,三、同工酶的检测,2、例：LD琼脂糖电泳,（1）电泳,（2）染色,（3）洗脱背景色,（4）扫描区带（或将区带切下比色测定）,电泳结果是从正极向负极顺序：LD1，LD2，,LD3，LD4，LD5,第 二 节 酶测定技术,三、同工酶的检测,第 二 节 酶测定技术,三、同工酶的检测,3、巨分子酶对电泳分析同工酶的影响,（1）酶与免疫球蛋白形成复合物,（2）酶与其它蛋白形成复合物,（3）酶亚基与酶分子之间形成的聚合物,第 二 节 酶测定技术,第 二 节 酶测定技术,三、同工酶的检测,（二）层析法,（三）免疫分析法,（四）同工酶的其它分析方法,第 三 节 常用酶及同工酶测定的临床应用,一、血清酶,（一）、血清酶的来源与去路,1、血清酶的种类,分类依据：酶的来源以及在血浆中发挥催化,功能的情况。,（1）血浆特异酶：在血浆中发挥特定的催化,作用的酶（,血浆固有酶,）,来源：肝脏,第 三 节 常用酶及同工酶测定的临床应用,（一）、血清酶的来源与去路,1、血清酶的种类,分类依据：酶的来源以及在血浆中发挥催化功能的,情况。,（2）非血浆特异性酶：在血浆中很少发挥作用。,外分泌酶：来源于消化腺或其它外分泌腺 的酶。,细胞酶：存在于各组织细胞中进行代谢的酶类。第 三 节 常用酶及同工酶测定的临床应用,（一）、血清酶的来源与去路,2、血清酶的去路,血清酶的,半衰期,是指酶失活至原来活性一,半时所需要的时间。一般以半衰期代表酶从,血液中清除的快慢。,第 三 节 常用酶及同工酶测定的临床应用,（二）血清酶的生理差异,1、性别,CK，ALP及,-GT等有性别差异，男性,略高于女性。,2、年龄 新生儿略高于成人,实例：ALP 15岁增至成人的23倍,1015岁可达成人的35倍,20岁降至成人水平,第 三 节 常用酶及同工酶测定的临床应用,（二）血清酶的生理差异,3、进食,在高脂、高糖饮食后血清中ALP活性增高。,酗酒可使血清,-GT升高,第 三 节 常用酶及同工酶测定的临床应用,（二）血清酶的生理差异,4、运动,激烈的肌肉运动可使血清中多种酶如CK、,LD、AST、ALD 和ALT等活性升高，其升,高的幅度与运动量、运动时间、运动频率,及骨骼肌所含的酶量有关。,第 三 节 常用酶及同工酶测定的临床应用,（二）血清酶的生理差异,5、妊娠,妊娠期，胎盘组织可分泌一些酶进入母体,血液，比如：ALP,LD,LAP,ALT等，引起血清,中这些酶升高。,6、其它 血清中有些酶有种族差异。,第 三 节 常用酶及同工酶测定的临床应用,（三）血清酶的临床应用,第 三 节 常用酶及同工酶测定的临床应用,二、尿液酶,目前了解较多的尿液酶：,AMS、N-乙酰-,-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）白细胞酯酶,溶菌酶（LZM）、丙氨酸氨基肽酶（APP）,-葡萄糖苷酸酶（GRS）、亮氨酸氨基肽酶（LAP）,LD、ALP、-GT,第 三 节 常用酶及同工酶测定的临床应用,1、AMS-尿液淀粉酶,（1）来源：唾液腺或胰腺,（2）种类：S型（唾液腺型）和P型（胰腺型）,（3）用途：急性胰腺炎和急性腮腺炎,（4）干扰因素,a、诊断胰腺炎的时候，应排除肾病和巨淀粉酶血症.,b、尿液淀粉酶的活性影响因素：酸尿、草酸盐、柠檬酸盐,可抑制该酶活性；磺胺类药物、止痛药可使该酶活性增高。,c、急性阑尾炎、肠梗阻、胰腺癌等可使AMS升高。,第 三 节 常用酶及同工酶测定的临床应用,二、尿液酶,（二）NAG：N-乙酰-,-D-氨基葡萄糖苷酶,1、来源：肾近曲小管上皮细胞,2、用途,（1）各种肾实质早期损伤的敏感标志物,（2）糖尿病性肾病早期发现和病程监测的重要项,目,（3）反映肾病综合症、肾小球肾炎、高血压肾病,和视网膜病的发展。,（4）用于药物治疗时毒性反应，肾重金属毒害、,肾移植排异监测等。,第 三 节 常用酶及同工酶测定的临床应用,三、浆膜腔积液酶,浆膜腔：人体的胸腔、腹腔和心包腔、关,节腔的统称。,浆膜腔积液：病理状态下浆膜腔内大量的,液体潴留。,第 三 节 常用酶及同工酶测定的临床应用,三、浆膜腔积液酶,（一）腹水：腹腔内的过多积液,1、腹水中的主要酶：LD 和ADA等,2、临床意义,（1）结核性渗出液：ADA升高,（2）恶性腹水：ADA偏低,（3）胰腺炎或胰腺创伤：AMS增高,第 三 节 常用酶及同工酶测定的临床应用,三、浆膜腔积液酶,（二）胸腔积液,1、分类,（1）,漏出液：代偿性心力衰竭,（2）渗出液：肺炎、恶性肿瘤或肺栓塞,2、临床意义：（1）LD200U/L为漏出液,LD200U/L为,渗出液,（2）ADA该酶用于结核性胸腔积液的诊断。,（3）AMS：急性胰腺炎、胰腺创伤,（4）癌症检测：胸腔积ACE25U/L，胸腔,积液ACE/血清中ACE的比值1,第 三 节 常用酶及同工酶测定的临床应用,三、浆膜腔积液酶,（三）心包积液,1、心包液正常值：20ml，超过50ml为心包积液。,2、常用酶测定及诊断：,（1）LD：,200U/L为漏出液，200U/L为渗,出液。,（2）ADA50U/L，溶菌酶80mg/ml时，,不排除结核性心包积液。,第 三 节 常用酶及同工酶测定的临床应用,四、脑脊液酶,（一）CSF-ALTCSF-AST,1、正常活性：是血清中的1/2。,2、临床诊断意义：,（1）诊断脑梗死、脑萎缩、急性颅脑性损,伤，中毒性脑病及中枢神经系统转移癌等。,（2）用于老年痴呆的诊断。,第 三 节 常用酶及同工酶测定的临床应用,四、脑脊液酶,（二）CSF-LD及其同工酶,1、正常值：血清活性酶的1/10。,2、临床诊断意义：,（1）细菌性脑膜炎,（2）脑梗死、脑出血或蛛网膜下腔出血的急性期。,（3）急性缺血性脑血管病患治疗和病情判断的指标。,（4）脑癌转移瘤和癌性脑膜炎的辅助诊断指标。,第 三 节 常用酶及同工酶测定的临床应用,四、脑脊液酶,（三）CSF-NSE：烯醇化酶,1、种类：五种同工酶-,、,、,2、临床诊断：（1）诊断急性脑血管病的病兆大小、脑损伤,程度及预后。,（2）癫痫持续状态后脑损伤的敏感指标。,（3）新生儿缺氧缺血性脑病、心源性脑缺氧,缺血、AD、VD等疾病诊断指标。,第 三 节 常用酶及同工酶测定的临床应用,四、脑脊液酶,（四）CSF-ADA,该酶用于结核性脑膜炎的鉴别与诊断。,第 三 节 常用酶及同工酶测定的临床应用,四、脑脊液酶,（五）脑脊液溶酶菌,常用于细菌性脑膜炎和结核性脑膜炎的诊,断。,第 三 节 常用酶及同工酶测定的临床应用,四、脑脊液酶,（六）CSF-CK、CSF-CK-BB,临床意义：常用于化脓性脑膜炎、结核性,脑膜炎、进行性脑积水、继发性癫痫、多发,性硬化症、蛛网膜下腔出血、慢性硬膜下水,肿、脑供血不足等疾病的诊断。,第 三 节 常用酶及同工酶测定的临床应用,四、脑脊液酶,（七）CSF-,1,-AT：急性炎症反应性糖蛋白,临床上当CNS病变时，比如化脓性脑膜炎,时该蛋白增高值很显著。为正常人的175倍。,结核性脑膜炎，其为正常人的65倍。,第 三 节 常用酶及同工酶测定的临床应用,五、同工酶的诊断价值,（一）临床上常用的同工酶有,1、LD：常用于心肌梗死、肝功能损伤、恶,性肿瘤的诊断。,2、CK：心肌梗死、肌肉疾病及神经系统疾、,病。,3、ALP：肝胆疾病、骨骼疾病的诊断。,4、ACP：前列腺疾病及相关肿瘤的诊断。,5、AST：用于肝脏、心肌细胞的损伤程度的判断。,6、ARS：膀胱癌的诊断。,第 三 节 常用酶及同工酶测定的临床应用,六、病例分析,1、,