第四章代谢工程的基本思想.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,硕士论文答辩,天津科技大学硕士论文答辩,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,代谢工程,Metabolic Engineering,第四章 代谢工程的基本思想,生物合成途径的遗传控制,2,生物发酵条件的控制,2,生物发酵条件的控制,3,代谢工程基本概念,1,代谢工程实例,4,一、基本概念,微生物群体的活动是一个动态过程,伴随能量形式的转换而发生的,电子流动,伴随异化和同化作用而发生的,物质流动,伴随不同水平上的代谢调节而发生的,信息流动,一、基本概念,反应:,途径:,网络:,A,B,A,B,C,D,A,B,C,E,D,一、基本概念,A,B,C,E,D,反应,中间代谢物,激活的反应,失活的反应,底物,产物,一、基本概念,A,B,C,E,D,交换代谢流,胞内代谢流,代谢流和碳架物质流,：代谢物在代谢途径中流动形成代谢流。在代谢工程领域，代谢流往往是指碳架物质流,一、基本概念,代谢主流的变动性和选择性、载流途径,一、基本概念,理 想 载 流 途 径,一、基本概念,代谢控制分析,通过某一途径的物流和以流量控制系数来表示的酶活之间的定量关系。流量控制被分布在途径的所有步骤中，只是若干步骤的流量比其他的更大些，可用数学方程来描述代谢网络内的控制机制。,流量控制系数,流量的百分比变化除以某一酶活（该酶能引起流量的改变）的百分比变化称为流量控制系数,弹性系数,表示酶催化反应速率对代谢物浓度的敏感性。弹性系数是个别酶的特性,微生物代谢的人工控制,微生物在正常情况下，通过细胞内自我调节，维持各个代谢途径的相互协调，使其代谢产物既不少又不会过多的积累，而人类利用微生物进行发酵则需要微生物积累较多的代谢产物，为此对微生物的代谢必须进行人工控制,人工控制微生物代谢的方法主要有两种,改变微生物的遗传特征,控制发酵条件,五字策略：,进、通、节、堵、出,二、生物合成途径的遗传控制,二、生物合成途径的遗传控制,遗传改造,营养缺陷型,抗反馈调节,产物降解酶缺失,增加前体物的合成,细胞膜组分缺失,营养缺陷型,营养缺陷型（,auxotroph,）,：野生型菌株经诱变剂处理后，由于发生了丧失某种酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变菌株,野生型（,wild type,）,：从自然界分离到的、发生营养缺陷型突变前的原始菌株,原养型（,prototroph,）,：营养缺陷型经回复突变或重组，回到原来野生型的营养要求,二、生物合成途径的遗传控制,营养缺陷型,终产物,D,对途径第一个酶有反馈抑制或阻遏作用。选育失去,CD,的能力的,D,的营养缺陷型突变株，在培养基中添加,D,使之足以维持生长，但不足引起反馈抑制与阻遏，则解除了,D,对此途径的反馈调节，那么中间产物,C,得以大量积累。这类菌株不能积累末端产物，只能积累中间产物,无分支途径,二、生物合成途径的遗传控制,营养缺陷型,谷氨酸棒杆菌鸟氨酸生物合成途径,乙酰谷氨酸合成酶,乙酰谷氨酸激酶,NO,乙酰谷氨酸醛脱氢酶,乙酰鸟氨酸转氨酶,乙酰鸟氨酸乙酰基转移酶,鸟氨酸氨甲酰基转移酶,精氨琥珀酸合成酶,精氨琥珀酸酶,二、生物合成途径的遗传控制,营养缺陷型,当菌株失去,CD,的能力即,D,或,E,缺陷型突变株。解除了,E,、,G,对第一个酶的协同反馈调节。当培养基中限量添加,E,，那么只剩下,G对,CF,转变的控制。,F,、,G,不会过量生成，而使,C,得以积累,分支途径,二、生物合成途径的遗传控制,营养缺陷型,双缺陷型突变株。,F,-,、,D,-,分支途径,二、生物合成途径的遗传控制,营养缺陷型,菌株失去了,FG,的能力，因此限量添加,G,可以积累,F,分支途径,二、生物合成途径的遗传控制,营养缺陷型,通常,I,、,E,协同反馈调节途径第一个酶，但该菌株丧失了,CF,的能力，是,I,、,G,的双缺陷型突变株。若在培养基中亚适量添加,I,、,G,，那么就解除了,I,、,E,对第一个酶的协同反馈调节，使终产物,E,大量积累，所以只要选育,F,-,或,G,-,、,I,-,缺陷型突变株就可以积累,E,分支途径,二、生物合成途径的遗传控制,天冬氨酸,甲硫氨酸,苏氨酸,赖氨酸,中间产物,天冬氨酸激酶,中间产物,抑制,高丝氨酸,高丝氨酸,脱氢酶,不能合成,营养缺陷型,二、生物合成途径的遗传控制,渗漏缺陷型,渗漏缺陷型,是一种不完全营养缺陷型，它不会产生过量的末端产物，因而可以避开反馈调节。但它又能合成微量的末端产物，用来进行生物合成；在培养这种突变体时，可不必在培养基中添加相应的物质，就能积累所需的产物,二、生物合成途径的遗传控制,抗反馈调节,在以积累末端产物为目的的发酵生产中，如果代谢途径单一无分支，往往不能选用营养缺陷型突变株。要提高产量，最好采用抗反馈调节突变株,抗反馈调节突变株,由于基因突变，它们的酶或无活性的原阻遏物不再与末端产物结合，从而不再发生酶的变构及阻遏物的活化，或者活性阻遏物不能再与发生了突变的操纵基因结合，因此反馈调节被打破，即使在末端产物过量的情况下，也同样可以积累高浓度的末端产物,选育抗结构类似物的突变株,从营养缺陷型回复突变株中获得对途径中调节酶解除反馈抑制的突变株,二、生物合成途径的遗传控制,抗结构类似物,抗反馈突变株通常可以用添加末端产物结构类似物的方法来筛选。末端产物类似物和末端产物结构类似，因而能够引起反馈，但是它们不能参与生物合成,在培养基中添加末端产物类似物后，未突变的细胞将由于代谢途径受阻而不能获得生物合成所需的该种末端产物，从而导致细胞死亡。那些对类似物不敏感的突变体，则由于原来受反馈控制的酶的结构，或是酶的合成系统已经发生了改变，它们不再受抑制或阻遏的影响，在类似物充斥的情况下照常能合成该种末端产物,苏氨酸,-氨基-羟基戊酸,二、生物合成途径的遗传控制,回复突变,调节酶的变构特性是由它的结构基因决定的，若调节酶因编码它的基因发生突变而失活，则有两种可能：,编码催化亚基与调节亚基的基因发生了变化,编码催化亚基（或活性部位）的基因发生变化,若通过再次突变，使调节酶的活性恢复，这时又有两种可能：,催化亚基和调节亚基恢复（或大体恢复）到第一次突变前那样的状态,催化亚基得到恢复，而调节亚基却丧失了调节作用，这情况实质上是编码调节亚基的,DNA,突变，解除了反馈抑制作用,调节酶的失活与否，可能直接表现为某种营养缺陷型。可以采用营养缺陷型的回复突变的方法，从,营养缺陷型回复突变株,中获得对途径中的调节酶解除反馈调节的调节突变株,二、生物合成途径的遗传控制,产物降解酶缺失,为了使产物在发酵液中稳定地存在，以提高发酵单位，可通过诱变获得缺乏降解产物酶的突变株,原产物生长菌株,NTG、DES、UV,完全培养基,产物为唯一碳源的,基本培养基（-）,葡萄糖培养基,生长因子（+）,诱变选育,二、生物合成途径的遗传控制,增加前体物的合成,通过选育某些营养缺陷型或结构类似物抗性突变株以及克隆某些关键酶的方法，增加目的产物的前体合成有利于目的产物的大量积累,二、生物合成途径的遗传控制,细胞膜组分缺失,生物素缺陷型,油酸缺陷型,甘油缺陷型,温度敏感突变株,添加表面活性剂,添加青霉素,二、生物合成途径的遗传控制,细胞膜组分缺失,生物素缺陷型,使用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酵培养基中生物素的浓度控制脂肪酸生物合成，从而控制磷脂的合成,作用机制：生物素作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰,CoA,羧化酶的辅酶，参与脂肪酸的合成，进而影响磷脂的合成。当磷脂合成减少到正常量的一半左右时，细胞变形，谷氨酸向膜外漏出，积累于发酵液中,二、生物合成途径的遗传控制,细胞膜组分缺失,油酸缺陷型,使用油酸缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酸培养基中油酸的浓度而控制磷脂的合成,作用机制：由于油酸缺陷突变株阻断了油酸的后期合成，丧失了自身合成油酸的能力；即丧失脂肪酸生物合成能力，必须由外界供给油酸，才能生长。故油酸含量的多少，直接影响到磷脂合成量的多少和细胞膜的渗透性；通过控制油酸亚适量，使磷脂合成量减少到正常量的,1/2,左右时，细胞变形，谷氨酸分泌于细胞外,二、生物合成途径的遗传控制,细胞膜组分缺失,甘油缺陷型,使用甘油缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酵培养基中甘油的浓度而控制磷脂的合成,作用机制：甘油缺陷突变株的遗传阻碍是丧失,-,磷酸甘油脱氢酶，所以自身不能合成,-,磷酸甘油和磷脂，必须由外界供给甘油才能生长。在甘油限量供应下，由于控制了细胞膜中与渗透性有直接关系的磷脂含量，从而使谷氨酸得以积累,二、生物合成途径的遗传控制,细胞膜组分缺失,温度敏感突变株,与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜的结构基因上发生碱基的转换或颠换，突变基因所指导翻译的酶，在高温时失活，导致细胞膜某些结构的改变。发酵过程中，在温度转换之后，进行适度地剩余生长，完成从谷氨酸非积累型细胞向谷氨酸积累型细胞的转变，仅通过采用控制温度就能实现谷氨酸高产,二、生物合成途径的遗传控制,细胞膜组分缺失,添加表面活性剂,表面活性剂作为生物素的拮抗物具有抑制脂肪酸的合成作用，导致磷脂合成不足，结果形成磷脂不足的细胞膜，提高了细胞膜对谷氨酸的渗透性,添加青霉素,抑制转肽酶活性，破坏细胞壁合成,二、生物合成途径的遗传控制,基因工程,基因扩增,强化代谢合成途径,异源基因导入,引入新的代谢反应,基因突变,改变酶学性质,基因敲除,阻断代谢通路,代谢网络重构与优化,二、生物合成途径的遗传控制,三、生物发酵条件的控制,当菌株选育（,内因,）确定后，环境条件（,外因,）合适与否是发酵成败的重要因素。环境条件既影响微生物生长，又影响代谢速度和方向及产物形成与积累,内因,外因,环境因素对谷氨酸发酵影响,三、生物发酵条件的控制,发酵控制要解决的两个问题,发酵代谢途径问题,-,副产物少,发酵代谢速度问题,-,产物生成速率快,调控发酵条件包括,发酵温度、发酵醪基质浓度、含氧量、酸碱度、发酵时间,控制方法有,:,通风、供热（冷）、调节培养基、流加补料,三、生物发酵条件的控制,四、柠檬酸发酵,黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是，葡萄糖经,EMP,、,HMP,途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰,CoA,，另一方面经,CO,2,固定化反应生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰,CoA,缩合生成柠檬酸,生长期与产酸期都存在,EMP,与,HMP,途径，前者,EMP:HMP=2:1,，后者,EMP:HMP=4:1,黑曲霉柠檬酸产生菌中存在,TCA,循环与乙醛酸循环，在以糖质原料发酵时，当柠檬酸积累时，,TCA,和乙醛酸循环被阻断或减弱,由于,TCA,和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸是由丙酮酸或磷酸烯醇式丙酮酸羧化生成的。即由两个,CO,2,固定化反应体系，其中以丙酮酸羧化酶作用下固定化,CO,2,生成草酰乙酸为主,生物合成途径,四、柠檬酸发酵,发酵产率,无CO,2,固定反应的产率,理论产率为：,192/(1801.5)=71.1%,有CO,2,固定反应的产率,理论产率为：,192/180=106.7%,正常情况下，柠檬酸、,ATP,对磷酸果糖激酶有抑制作用，而,AMP,、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，特别是还能解除柠檬酸、,ATP,对磷酸果糖激酶的抑制作用,铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，细胞内铵离子浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感,锰缺乏时，细胞内铵离子浓度高，氨基酸浓度高（蛋白合成受阻，导致升高）。因此，锰离子效应是通过升高铵离子而减少柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制来实现的,代谢调节,糖酵解及丙酮酸代谢的调节,四、柠檬酸发酵,糖酵解的代谢调节,四、柠檬酸发酵,TCA,环的起始酶,-,柠檬酸合成酶是一种调节酶。但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉,TCA,环的第一个特点,顺乌头酸酶失活，阻断,TCA,环是柠檬酸积累的必要条件，顺乌头酸水合酶需要,Fe,2,。顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在,pH2.0,时失活。顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸,=90,：,3,：,7,黑曲霉菌体内,-,酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低，它被葡萄糖和,NH,4,抑止（第二个特点）,代谢调节,TCA循环的调节,四、柠檬酸发酵,TCA循环的调节,四、柠檬酸发酵,氧是发酵过程（,EMP,途径和丙酮酸脱氢）生成的,NADH,2,重新氧化时所需,标准呼吸链产生,ATP,积累，侧呼吸链不产生,ATP,，缺氧导致侧呼吸链失活，使,ATP,积累，柠檬酸积累减少,当缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会导致此侧系呼吸链的不可逆失活，而导致柠檬酸产酸急剧下降,代谢调节,氧对柠檬酸积累的调节,四、柠檬酸发酵,透明圈大的菌株,平板：,10%,甘薯,+2%,的琼脂,+0.5%CaCO,3诱变后，涂布，透明圈大的则好,显色圈大的菌株,平板：麦汁培养基,+pH,值指示剂诱变后，,33,培养,3,天，透明圈大的则好,耐高柠檬酸且不分解柠檬酸的菌株,不利用柠檬酸为碳源的菌株，说明其,TCA,循环中柠檬酸后续酶的活性较低，或者丧失，这有利于积累柠檬酸。方法：以柠檬酸为唯一碳源的培养基上生长不好的突变株,代谢控制育种,四、柠檬酸发酵,选育不长孢子、少长孢子、迟长孢子的菌株,在培养基中如果菌株能够大量合成积累柠檬酸，自然会使,TCA,循环中的中间产物浓度降低，这样不利于孢子的形成,选育单氟乙酸、三氟乙酸敏感突变株,抑制乌头酸梅和异柠檬酸脱氢酶活性。若菌体对药品敏感，说明该突变株的乌头酸酶和异柠檬酸酶活力低或含量少,选育强化,CO,2,固定反应的突变株,氟丙酮酸敏感、天冬氨酸缺陷、羧化酶基因克隆,强化柠檬合成酶,代谢控制育种,四、柠檬酸发酵,控制,Mn,2+,和,NH,4,+,浓度，解除柠檬酸对,PFK,的抑制，使,EMP,畅通无阻,控制,Fe,2+,浓度，使顺乌头酸水合酶失活,控制,pH3,，,pH,碱性，草酸增加；,pH,中性，葡萄糖酸增加,加大生物素用量，激活丙酮酸羧化酶,发酵控制,四、柠檬酸发酵,五、L-色氨酸发酵,生物合成途径,操纵子,五、L-色氨酸发酵,育种策略,进、通、节、堵、出,五、L-色氨酸发酵,育种策略,解除反馈调节作用,选育,5-,氟色氨酸、,5-,甲基色氨酸抗性突变株,敲除,trpR,基因，解除关键酶受到的反馈阻遏,替换启动子，去除弱化作用,阻断色氨酸分解代谢,选育不利用色氨酸的突变株,敲除色氨酸分解酶基因,tnaA,五、L-色氨酸发酵,育种策略,改变中心代谢途径流向，增加前体物,PEP,和,E4P,供应量,失活或弱化,PEP,羧化酶和丙酮酸激酶,增强,PEP,合成酶活性,通过增加葡萄糖激酶,(,glk,),对磷酸葡萄糖的活性用,ATP,取代,PEP,以消除,PTS,系统,超量表达非氧化阶段的磷酸戊糖途径的酶，如转酮酶和转醛酶,失活磷酸葡萄糖异构酶,五、L-色氨酸发酵,育种策略,增加莽草酸途径和色氨酸分支途径的代谢流,过量表达基因,aroG,提高,DAHP合成酶,（,DS,）活性,选育酪氨酸和苯丙氨酸缺陷的突变株,克隆解除反馈抑制的色氨酸操纵子,克隆丝氨酸（色氨酸合成前体物）合成途径上的关键酶基因,serA,修饰芳香族氨基酸转运系统,失活色氨酸输入相关基因,增强色氨酸输出相关基因,五、L-色氨酸发酵,生物合成途径,六、鸟苷发酵,代谢调节,六、鸟苷发酵,育种策略,解除反馈调节作用,选育抗鸟嘌呤结构类似物的突变株,选育抗腺苷及腺嘌呤结构类似物的突变株,消除或减弱鸟苷的进一步代谢,选育不分解利用鸟苷的菌株,选育核苷磷酸化酶活性弱的菌株,选育核苷膜透过性强的菌株，使合成的鸟苷不断从细胞内渗透到细胞外,六、鸟苷发酵,育种策略,阻断或减弱支路代谢，增加前体物的合成,选育转酮酶缺陷的突变株,选育莽草酸缺陷突变株,选育腺嘌呤缺陷突变株,选育,5-,核苷酸酶活性微弱的菌株,选育,GMP,还原酶活性丧失或微弱的菌株,选育组氨酸缺陷突变株,选育硫胺素（,V,B1,）缺陷突变株,克隆合成途径关键酶基因,六、鸟苷发酵,七、青霉素发酵,生物合成途径,代谢调节,青霉素的生物合成受碳分解代谢产物阻遏，如,ACV,合成酶，,IPN,合成酶，酰基转移酶就被阻遏,葡萄糖可以刺激菌体生长，使作为赖氨酸和青霉素合成中间体的,-,氨基己二酸转向合成赖氨酸，抑制青霉素的合成,葡萄糖降低青霉素生物合成的速率和得率还由于葡萄糖与,6-APA,之间形成复合物，从而减少了可用于合成青霉素的中间产物。,碳源的缓慢利用是大量合成青霉素的关键,碳分解代谢产物,的影响,七、青霉素发酵,代谢调节,-,氨基己二酸的初级代谢产物是赖氨酸，分支次级代谢产物是青霉素,赖氨酸能抑制青霉素的合成，,-,氨基己二酸能逆转这种抑制,赖氨酸能反馈抑制高柠檬酸合成酶，导致,-,氨基己二酸合成受阻，因而减少青霉素的合成,赖氨酸的反馈调节,七、青霉素发酵,代谢调节,赖氨酸的反馈调节,七、青霉素发酵,代谢调节,产黄青霉生物合成青霉素能,被高浓度的铵离子抑制，,NH,4,+,还能直接阻遏产黄青霉的青霉素合成基因的表达,磷酸盐可强化产黄青霉的葡萄糖阻遏,硫酸盐作为前体氨基酸半胱氨酸合成酶原料，在青霉素合成中起着重要作用。高浓度的硫酸盐阻遏低产产黄青霉菌株的硫酸盐通透酶而影响摄取，在硫酸盐饥饿时，该酶活性及硫酸盐摄取率上升,其它反馈调节,七、青霉素发酵,育种策略,解除反馈调节作用,选育三氟亮氨酸，正缬氨酸，,L-,烯丙基甘氨酸等抗性突变株,选育自身耐受性突变株,选育,-,氨基己二酸缺陷的回复突变株,选育半胱氨酸、异亮氨酸或苏氨酸缺陷的回复突变株,选育苯乙酸，苯乙酰胺抗性突变株,阻断支路代谢,选育亮氨酸营养缺陷型,选育赖氨酸营养缺陷型,七、青霉素发酵,育种策略,增加前体物供给,选育缬氨酸对乙酰羟酸合成酶抑制程度低的菌株,克隆同型柠檬酸合成酶基因，增加,-,氨基己二酸的量,克隆青霉素,G,酰化酶基因，强化青霉素生物合成能力,选育细胞膜渗透性好的突变株,产黄青霉菌如果膜渗透性发生改变，使其摄取无机硫酸盐的能力提高,七、青霉素发酵,发酵控制,乳糖是最好的碳源，葡萄糖也较好，但需控制其加入的浓度，因为高浓度的葡萄糖对一些酶具有阻遏作用,。,常采用连续添加葡萄糖的方法代替乳糖,侧链前体物质应少量多次补入，控制在亚抑制水平（供应速率略大于生物合成需要），以减少前体的氧化，提高前体结合到产物中的比例,采取变温控制。生长阶段温度较高，缩短生长时间；合成阶段适当降低温度，以利于青霉素的合成，减少青霉素降解,七、青霉素发酵,谢 谢！,