HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断.ppt

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Click to edit Master title style,HPV,分子生物学,及宫颈病变病理诊断,彭振武,PZW7509163.COM,广州安必平医药科技有限公司,一，,HPV,简介,二，,HPV,与宫颈癌的关系,三，,HPV,相关细胞学形态改变及判读要点,四，,HPV,检测方法及宫颈病变的病理诊断,五，,HPV,疫苗的研究进展,（一）,HPV,简介,1.,完整的病毒颗粒为一个感染单位，外形呈,20,面体对称型，外壳有,72,个衣壳体。,2.HPV,基因组为环状双链,DNA,，含有近,8000,个碱基对。分为早期区，晚期区和长控区。,Human papillomavirus,（,HPV,）,早期转录区：参与病毒,DNA,的复制，转录，翻译，调控和细胞转化。,晚期转录区：编码病毒的衣壳蛋白。,上游调控区：又称长控区，通过与转录因子的相互作用调节早期区基因的转录，参与病毒复制，转录的调控。,（二）,HPV,与宫颈癌的关系,宫颈癌是第一个被确定有单一明确病因的癌症，即高危型,HPV,感染。,HPV,感染普遍存在，但是引起的宫颈癌却相对少见。,高危型,HPV,总感染率大概在,10%,，,15,岁到,25,岁感染率最高。,HPV,感染平均为,6-9,个月，,70%,的,HPV,感染在一年内清楚，两年内的清除率可达,90%,HPV,感染引起的低度病变（,CIN1,）不是癌前病变，大多会自然转愈，对于任何致癌性,HPV,，诊断,CIN1,并不意味着发展成,CIN3,的风险比活检阴性者高。,HPV,病毒量的多少跟宫颈癌的发生有一定的相关性，但是不成正比，不能预测疾病的进展。,有效预防,HPV,感染，就能减少甚至不得宫颈癌。,通过微小破损感染上皮组织。,通过胞吞作用使整个病毒颗粒侵入上皮基底层细胞，继而通过不明的机制被传送到细胞核。,正常情况下，病毒基因中的,E1,，,E2,，,E4,，,E5,低表达，有利于病毒基因组的维持和细胞增生。表达水平增高促进病毒基因组复制。,随着宿主角质细胞开始分裂并逐渐分化为上皮表层，,L1,和,L2,蛋白表达促使病毒组装形成感染性病毒颗粒，而,E4,高表达则使细胞胞浆破坏，凹陷，促进病毒释放。,HPV,自然生活史（游离状态）,高危型,HPV,病毒持续性感染。,病毒,DNA,与宿主细胞,DNA,发生整合，病毒与之整合的部 位位于,E2,编码区。,HPV,整合导致,E2,片段缺失，失去了对,E6,，,E7,的正常调控，导致其过度表达。,E6,与,P53,结合并使之降解，并能阻止和干扰细胞凋亡，引起细胞无限增生并向恶性转化。,E7,与,pRB,结合，使,E2F,得以释放，从而使细胞周期由,G1,期向,S,期转化，细胞周期失控而发生永生化。,E6,，,E7,编码的原癌蛋白表达，导致人类染色体端粒体酶逆转录酶基因（,hTERC,）扩增，维持端粒长度，细胞永生，免于凋亡，发生癌变。,HPV,致癌机制（整合状态）,宫颈癌发生过程：,一过性,HPV,感染,持续性,HPV,感染,HPV,病毒,正常宫颈,初次感染,清除,HPV,感染的宫颈,进展,逆转,癌前病变,宫颈癌,浸润,中度细胞学异常,（三）,HPV,相关细胞学形态改变及判读要点,多数,HPV,感染并没有细胞学异常，大约只有,30%,的,HPV,感染会产生相应的细胞病理学变化。,HPV,引起的细胞学形态改变不仅仅表现挖空细胞特征，还包括,ASC,和,HSIL,的病变特点。,挖空细胞只说明有,HPV,感染，但无法分清楚是低危型还是高危型。,HPV,分子生物学行为对应,TBS,报告术语。,典型的挖空细胞判读为,LSIL,，不典型的挖空细胞判读为,ASC-US,或,ASC-H.,理解,LSIL,的定义，其实就是要弄清楚以下这个问题：,组织学的,CIN1,指的是下,1/3,的细胞异型，而与之对应的,LSIL,则是表层细胞形态的异常，如何解释？,LSIL,LSIL,糖原溶解细胞,VS,挖空细胞,LSIL,（,HPV,病毒游离状态，一过性感染）,细胞学诊断的要点：,1.,细胞成熟，为表层细胞来源。,2.,核周空晕透亮，为胞浆塌陷或被破坏造成。,LSIL ASC-US,ASC-US,ASC-US,（可疑,HPV,一过性感染，无典型挖空表现）,细胞学诊断要点：,1.,核有一定异型，有挖空趋势，但核周空晕不透亮。,2.,成片聚集的表层细胞，核轻度增大或双核，可伴有角化不全现象。,HSIL,HSIL,（,HPV,病毒整合状态，持续性感染）,细胞学诊断要点：,1.,高核浆比。,2.,核的异型性，主要体现在核膜的不规则以及核染色质增粗。,CIN3,CIN3,CIN3,（,HPV,病毒整合状态，持续感染，向宫颈癌进展）,组织学诊断要点：,1.,核异型明显（肿瘤异倍体细胞的表现）。,2.,中表层细胞出现病理性核分裂像。,3.,全层细胞密度增加，极性紊乱，丧失正常的组织结构。,4.,表层细胞不出现典型的挖空细胞形态。,（四）,HPV,检测方法及宫颈病变的病理诊断,HPV,检测：,1.,病毒,DNA,检测,2.,病毒,mRNA,检测,3.,病毒相关蛋白检测,4.,病毒靶向检测,低危型,HPV,主要见于生殖器疣，常见的型别为,6,型和,11,型。,高危型,HPV,与癌前病变和宫颈癌相关，常见的型别为,16,型和,18,型。,检测方法有分型检测与不分型检测。,HPV-DNA,检测,HC2,（不分型）,操作步骤：,裂解杂交捕获抗原抗体反应信号放大结果判读,HC2,结果判读：,1.0pg/ml,为阳性，相当于,5000,拷贝。,如何正确理解,HC2,的检测结果？,PCR-RDB,（分型检测）,DA8000,全自动核酸分子杂交仪,HPV-DNA,分型检测的临床意义？,能区分持续或反复感染。,不同型别有不同的患病风险。,不同型别有不同的处理方案。,ASCCP2009,版指南指出：,30,岁女性,细胞学阴性，而,HPV16,或,18,型阳性者，建议阴道镜检测。,细胞学阴性，其它,HR-HPV,型阳性者，一年后复查,HPV-DN,和细胞学。,HPV E6,，,E7 mRNA,检测,HPV,的,E6,、,E7,是病毒癌基因，它们的翻译产物介导抑癌基因,p53,和,Rb,的降解，从而干扰细胞周期调节。如若癌基因没有表达，则细胞本身不会发生癌变。,E6,蛋白能与细胞内,E6,相关蛋白,(E6 AP),形成复合物,特异性地结合,p53,并通过依赖蛋白酶系统将其水解,使其对细胞生长负调节功能丧失,从而引起细胞无限增生并向恶性转化。,E7,蛋白是,HPV,的主要转化蛋白,与控制细胞周期有关的肿瘤抑制蛋白视网膜母细胞瘤蛋白,(Rb),亲和力极高,.E7,与,Rb,结合使,Rb E2F,复合物解离,E2F,被游离,从而发挥其转录因子的作用,导致细胞周期失控而发生永生化。,HPV E6/E7mRNA,在宫颈组织中表达，说明,HPV,病毒表达出癌基因活性。,bDNA,技术原理,HPV,相关蛋白检测,人体的细胞周期包括,G1,，,S,G2,，,M,四个时相，且存在多个检查点调节各时相点的转换及细胞周期进程。其中以,G1S,期最为重要，因为细胞一旦从,G1,期进入,S,期，则不再依赖外界信息刺激而很快自动完成分裂过程，因此,G1,卡点可以决定细胞继续增值或进入,G0,期或离开细胞周期进入终末分化或死亡。,细胞周期卡点的转换受控于“细胞周期蛋白（,cyclins,）,-,细胞周期依赖性激酶（,cdks,）,-,细胞周期依赖性激酶抑制因子（,clks,）”这组分子网络。,研究最为广泛的一组是：,Cyclin D1/cdk4/P16,。,P16,在细胞周期,G1,卡点中与,CyclinD1,竞争结合,cdk4,并特异性抑制其活性，组织细胞尤其是带有损伤,DNA,的细胞进入,S,期，从而控制细胞分裂。,P16,：,1.,在,LSIL,的敏感性和特异性为,74%,，在,HSIL,中则达到,97%,以上。,2.,在,LSIL,中的表达为点状，散在分布；在,HSIL,中的表达为灶状，片状连续分布。,P16,P16,Cyclin D1,：,1.,在正常宫颈组织中低表达，在,CIN,和宫颈鳞癌中表达增加并逐渐加强。,2.,促进细胞周期紊乱，细胞异常增殖。,CyclinD1,过度表达可能导致细胞,G1,期缩短，细胞过度增殖失控而促进肿瘤的发生。,Ki-67:,1.,在细胞周期的,G1,后期，,S,G2,，,M,期呈高表达，而在静止的,G0,期细胞呈低表达。,2.Ki-67,半衰期短，脱离细胞周期后迅速降解，检测结果的可靠性明显优于半衰期长的增殖细胞核抗原，是最能反映细胞增殖状态的蛋白标志物之一。,3.Ki-67,用于,CIN,的鉴别诊断，主要用于萎缩性病例，而对反应性改变，化生性改变，修复性改变意义不大（细胞增殖指数也很高）。,Ki-67,HPV,分子靶向检测,hTERC:,宫颈细胞由非典型性发育异常向宫颈癌转变的过程中几乎都伴有,3,号染色体长臂扩增。其中，涉及到的最重要的基因可能是人类染色体末端酶（,hTERC,）基因。该基因的扩增可阻止细胞凋亡，因而可导致肿瘤产生。现已得知，,3,号染色体长臂扩增能准确区分宫颈细胞高度癌前病变与低度癌前发育异常，鉴别诊断的敏感性及特异性均在,90%,以上,人类染色体末端酶基因,-hTERC,基因,hTERC,基因定位在,3q26.3,hTERC,基因的作用：,编码人类染色体端粒酶的重要基因，影响细胞凋亡。,端粒酶活性,端粒,影响,影响,与细胞凋亡密切相关,hTERC,基因状态,TBS,分级,正常,/,炎症,ASCUS,ASC-H,LSIL,HSIL,TERC,基因扩增发生率（,%,）,4.6,13.5,28.6,25.2,87.7,病理分级,正常,/,炎症,CIN 1,CIN 2,CIN 3,原位癌,TERC,基因扩增发生率（,%,）,4.2,7.3,69.2,85.1,95.7,hTERC,检测的意义,49,ASCUS,CIN1,CIN2/3,TERC,基因,ASC,CIN1,LSIL,与,HSIL,的辅助判断指标,宫颈脱落细胞,FISH,探针,CSP3,TERC,hTERC,基因定位于,3q26.3,3,号染色体着丝粒信号,正常,扩增,hTERC,基因检测（,fish,）,（四）,HPV,疫苗,目前已分离出的,HPV,达,100,多型，其中至少,14,型可导致宫颈癌。,16,型与,18,型是最常见的高危型，大约,70%,宫颈癌由这两种型别引起。,6,型和,11,型是最常见的低危型，与,90%,生殖器尖锐湿疣相关。,中国：,HPV16,（,76.7%,），,HPV18,（,7.8%,），,HPV31,（,3.2%,），,HPV52,（,2.2%,），,HPV58,（,2.2%,）。,HPV,流行病学,HPV,疫苗：,四价疫苗（,6,11,16,18,）,2006,年,6,月，美国,FDA,正式批准美国默克公司生成的四价预防性疫苗,Gardasil,的注册。,建议针对,9-26,岁的女性使用。在美国和其它部分国家，该疫苗还被批准用于预防性男性生殖器疣。,二价疫苗（,16,18,）：,2007,年注册的英国葛兰素史克生成的二价疫苗,Cervarix.,批准用于,10,岁以上的女性。尚未申请在男性中使用的适应症。,疫苗为无菌混悬液，需储存在,2-8,环境下，不能冷冻。,肌肉注射，注射后观察,15,分钟。,接种分三次进行（第一针,1,或,2,个月后第二针，,6,个月后第三针）,对其它疫苗有严重过敏史的人或孕期女性禁用。,预防性,HPV,疫苗无法治疗已存在的病毒感染或相关病变。,治疗性疫苗需要进一步研制。,总结,HPV,病毒与宫颈病变关系密切，不同程度的宫颈病变其实就是,HPV,病毒感染机体后不同分子生物学行为的表现，而病变的多样化与病毒型别，机体抵抗力及个体差异相关联。,宫颈癌筛查最重要的目的是发现并且治疗那些经过初筛发现异常，并最终活检确诊为高级别或以上的病例。,宫颈病变,LISL,与,HSIL,的明确诊断，越来越有赖于多种检测项目的联合应用及准确分析。,谢谢大家的时间与关注！,