现代抗体技术和其应用优质PPT课件.ppt

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antibody,）；,第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体,(,monoclonal antibody,McAb),；,第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为基因工程抗体,(,genetic engineering antibody),。,多克隆抗体,多克隆抗体：有多个,B,细胞克隆所产上的对特定抗原所产生的,一组免疫球蛋白混合物,，每种免疫球蛋白能识别抗原分子上一个表位。所获得的的血清实际上是含有多种抗体的混合物。,多克隆抗体的制备,1.,制备抗原,2.,选择实验动物,3.,动物免疫,4.,试取血进行测试效价，看看是否成功免疫,5.,如果成功免疫，处死实验动物，采集全部血清,6.,纯化抗体,7.,鉴定抗体，包括纯度以及特异性,多克隆抗体的制备,-1.,制备抗原,1,颗粒抗原制备,细胞抗原,细菌类抗原,2,可溶性抗原纯化,纯化常用的方法：中性盐沉淀法、凝胶过滤层析法、离子交换层析法、免疫吸附亲和层析法。,3,半抗原的免疫原制备法,半抗原：多肽，甾族激素，药物，脂肪胺，核苷等小分子物质仅能与相应的抗体发生特异性结合反应，而它们本身并不是免疫原，不能刺激机体产生抗体。,半抗原免疫原制备,:,将小分子半抗原制备成免疫原通常可用物理吸附方法和化学方法。,多克隆抗体的制备,-2.,选择实验动物,供免疫用的动物主要是哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、山羊、马、骡和豚鼠及小鼠等。动物的选择根据抗体的用途和量来决定，也与抗原的性质有关。,动物的免疫应答受动物的遗传基因影响，同一种系的动物对不同抗原的免疫应答和不同种系的动物对同一抗原的免疫应答均不尽相同。抗原的来源与免疫动物的亲缘较远，产生的抗体效价高，同种系或亲缘较近，产生的抗体的效价就差。,如果需要大量抗体，则用大动物；如要获得直接标记诊断的抗体，则用本种动物；如要获得间接标记诊断的抗体，则用异源动物；如抗原量少，且难以获得，则用纯系小鼠；一般实验室用的抗体，多用兔或者鼠。对于用于诊断的抗体，最好用,SPF,级动物。,多克隆抗体的制备,-3.,动物免疫,抗原剂量：,抗原的免疫剂量应根据抗原的免疫原性强弱、抗原来源难易、动物的种类、免疫周期等来选择抗原剂量。,免疫剂量过低，不能引起足够强的免疫刺激，免疫剂量过多，有可能引起免疫耐受。在一定的范围内，抗体的效价是随注射剂量的增加而增高。蛋白质抗原的免疫剂量比多糖类抗原宽。一般情况下，小鼠的首次免疫剂量为,50,g,400,g/,次，大鼠为,100,g,1 000,g,次，家兔为,500,g,1 000,g/kg/,次，加强剂量为首次剂量的,1,2,1,3,。,多克隆抗体的制备,-3.,动物免疫,注射途径：,抗原的进入途径决定了抗原吸收、分布和代谢的速度。吸收越快，分解代谢越快，对机体影响的时间越短。吸收越快，单位时间的有效抗原量就越大，机体的免疫应答就越强，毒副作用也越强。根据免疫应答过程中各阶段的特点，选择注射途径。常用的途径有：静脉、脾脏、淋巴结、腹腔、肌肉、皮下、皮内、掌内、跖内皮下。对抗原吸收的速度：静脉,=脾脏=淋巴结腹腔肌肉皮下皮内掌内=跖内皮下。基础免疫应选择缓慢吸收的途径，延长抗原刺激时间。,多克隆抗体的制备,-3.,动物免疫,加强免疫时间：,与抗原的理化性质、剂量、进入途径、机体状况和所处的免疫应答阶段有关。抗原理化性质稳定，吸收分布速度慢或机体处于免疫应答的早期，应延长间隔时间。两次注射的间隔时间应长短适宜,太短起不到再次反应的效果，太长则失去了前一次激发的敏感作用。一般情况下，第一次加强免疫应在基础免疫后的,23,周，以后每,710,天加强一次。加佐剂间隔时间应为,2,周左右。注射的,Ig,纯度高，则一般不易引起过敏反应，如注射血清，即使是少量，在再次免疫时，极易引起过敏反应，所以一定要采取措施。,多克隆抗体的制备,-3.,动物免疫,加强免疫次数：,抗原的免疫原性强弱和动物对抗原的敏感性有关。抗原免疫原性弱，需多次加强才能获满意的抗血清。得制备高度特异性的抗血清,可选用低剂量抗原短程免疫法需要获得高效价的抗血清，宜采用大剂。量长程免疫法。免疫周期长者，可少量多次。免疫周期短者，应大量少次。最简单的方法是直接检测血清中的抗体滴度，观察免疫效果。,多克隆抗体的制备,-3.,动物免疫,佐剂的概念和种类,佐剂的概念：佐剂是非特异性的免疫增强剂，有些物质与抗原一起或预先注入机体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型。,佐剂的种类,1,）微生物及其产物：如分枝杆菌（结核杆菌、卡介苗,),短小棒状杆菌、白日咳杆菌、革兰氏阴性菌的内毒素。,2,）无机化合物：氢氧化铝、明矾等,3,）合成佐剂：如双链多聚肌胞苷酸（,polyI:C),4,）油剂：如弗氏佐剂、矿物油、植物油,多克隆抗体的制备,-3.,动物免疫,佐剂的生物学作用,增加抗原的免疫原性，使无或微弱免疫原物质变成有效的免疫原；提高抗体的滴度，提高初次免疫应答和再次免疫应答抗体的滴度；改变抗体的类型，由产生,IgM,转变成,IgG,；引起或增强迟发型超敏反应。,佐剂的作用机制,改变抗原物理性状，延缓抗原降解和排除，延长体内存留的时间，从而更有效的刺激免疫系统；,刺激单核巨噬细胞增强其对抗原的处理和递呈能力；,刺激淋巴细胞增生和分化，从而增强和扩大免疫应答的效应。,多克隆抗体的制备,-3.,动物免疫,方法一：淋巴结注射法,A.,在兔的两后足跖部皮下（或皮内）注射活卡介苗,50mg,（每侧约,0.30ml,）。,7-10,天后，兔跖及腘肌淋巴结肿大；,B.,于肿大的两侧淋巴结内各注射加有完全佐剂的乳化抗原,0.50ml,（含抗原蛋白,5mg/ml,，青霉素,1000U/ml,，链霉素,1000,g/ml,）；,C.,必要时，,14,天后，重复步骤,B,一次；,D.,再过,7,天后，于两侧淋巴结内各注射加有完全佐剂的乳化抗原,0.50ml,（含抗原蛋白,5mg/ml,，青霉素,1000U/ml,，链霉素,1000,g/ml,）；,E.5-7,天后，耳静脉采血。测定血清效价。,多克隆抗体的制备,-3.,动物免疫,方法二 皮下多点注射法,A.,家兔两侧掌（跖内各注射含有完全佐剂抗原,0.1ml,，,5mg/ml,）；,B.7-10,天后，脊柱两侧多点（颈，胸，腰椎各两点，共,6,点）皮下注射含不完全佐剂的抗原，每点,0.5ml,；,C.7-10,天后，脊柱两侧重复注射一次；,D.7-10,天后试血，不合格者重复步骤,D,。,多克隆抗体的制备,-3.,动物免疫,方法三 多途径联合注射法,A.,两侧掌（跖）内侧皮下注射含有完全佐剂抗原,0.5ml,，,5mg/ml,）；,B.14,天后，多点皮下注射含不完全佐剂的抗原，每点,0.5ml,；,C.7,天后，耳静脉注射不含有佐剂的抗原,2ml,；,D.,测定血清抗体效价，不合格者重复步骤,C,，并适当递增抗原量。,多克隆抗体的制备4.,效价评价,1.,琼脂扩散法,原理：用半固体琼脂凝胶作为介质，,可溶性抗原,，抗体在其中能自由扩散。将可溶性抗原和抗体分别加入琼脂板上相对应的孔中，两者各自向四周扩散，如果抗原和抗体相对应，则在两者比例适当处形成白色沉淀线，以出现沉淀线最高的抗体稀释度为该抗体的效价。,多克隆抗体的制备,-4.,效价评价,2.ELISA,法,（,一般用于可溶性抗原,）,若,ELISA,效,价达到,5,000,以上,(,即血清,稀释,5,000,倍,浓度,在,ELISA,有,50%,最高呈色,),，即可,进行全部采血,。,多克隆抗体的制备,-4.,效价评价,3.,凝集法,原理：颗粒型抗原（完整的病原微生物或者红细胞等）与相应抗体相结合，在有电介质存在的条件下，经过一定的时间，出现肉眼可见的凝集小块。血清效价代表血清中康天一的含量，血清效价越高，所含抗体的量越多。例如，伤寒沙门菌“,O,”抗体凝集效价在,1:80,以上才有诊断价值。,一般当效价达到,1,：,1600,到,1:3200,即可采血。,多克隆抗体的制备,-5.,血清制备,最后一次取血可以采用颈动脉放血（以家兔为例）,在收集全血时加入肝素抗凝，对收集到的全血在室温下静置,2hr,后，,4000rpm,离心,20min,，取出上层血清后，每,5mL,分装一管，冷冻保存,20,待用。,多克隆抗体的制备,-6.,抗体纯化,一般采用综合技术，避免蛋白变性。如分离,IgG,时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。提取,IgM,的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等,1.,亲和纯化,原理：蛋白,A,是从,Staphylococcus aureus,中获得，可与抗体重链的,Fc,片段相结合。现在已知蛋白,A,可与多种哺乳动物的,IgG,相结合也可与某些,IgM,和,IgA,相结合。如果将蛋白,A,与固相载体相连，例如,sepharose CL-4B,，这种填料可以成为分离和纯化不同类型，不同亚类抗体或抗体片断的重要工具。,多克隆抗体的制备,-6.,抗体纯化,2.,盐析法,原理：蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。,多克隆抗体的制备,-6.,抗体纯化,盐析法实验步骤,取,1Xml,血清加,1Xml,生理盐水，于搅拌下逐滴加入,2Xml,饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为,50%,。,4,沉降,3h,以上，使其充分沉淀离心（,3000rpm,），,20min,，丢弃上清，以,xml,生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵,x/2ml,。置,4,沉降,3h,以上。,重复上述第二步过程,1,2,次。末次离心后所得沉淀物为,-,球蛋白，以,0.02%mol/lpH7.4pbs,溶解至,xml,装入透析袋。对,PBS,充分透析、换液,3,次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无,NH4+,为止,。,多克隆抗体的制备,-6.,抗体纯化,3.,DEAE,离子交换层析法,离子交换层析是蛋白质纯化的常规方法，与硫酸氨沈淀法联合使用可以非常有效地纯化抗体,原理：,DEAE,是一种阴离子交换剂，当蛋白质溶液通过,DEAE,柱时，带负电荷的蛋白质可以被,DEAE,吸附，带正电荷的蛋白质则不被吸附而随溶液流出。纯化抗体时可选择,pH,值大于待纯化抗体等电点的缓冲液，此时抗体带负电荷可以通过电价键吸附于,DEAE,离子交换剂上，然后用增加盐浓度的方法将抗体洗脱。可以用连续梯度法洗脱，也可以用不连续梯度（分段洗脱）法洗脱。,多克隆抗体的制备,-6.,抗体纯化方法比较,多克隆抗体的制备,-7.,抗体鉴定,1.,纯度的鉴定,区带电泳、高效液相色谱、高压毛细管电泳,采用区带电泳的方法。若只出现一条蛋白区带说明抗体纯化已达到要求。,2.,特异性,抗体的特异性鉴定一般采用相似的抗原与待鉴定抗体反应。如果出现交叉反应，说明有交叉抗体的存在。此时，可用相应抗原吸收，以提高抗体的特异性。抗体的特异性以交叉反应率表示，其计算方法如下：交叉反应率,=,待测抗原,50%,结合时的浓度,/,待鉴定类似物,50%,结合时的浓度,100%,多克隆抗体的制备,-7.,抗体鉴定,3.,亲和性,抗体的亲和力（,affinity,）是指抗原与抗体结合的牢固程度。亲和力越大表示抗体的结合反应越快，抗原抗体复合物越不易解离。亲和力的大小是由分子的大小、抗体结合的位点、以及抗原决定簇之间的立体构型的适合程度决定的。亲和力决定实验方法的灵敏度。因此，亲和力是评价抗体质量的重要指标。抗体亲和力的大小以亲和常数表示，亲和常数就是表示抗血清中抗体分子的浓度。可用饱和曲线法进行计算。,单克隆抗体,单克隆抗体,将一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体,单克隆抗体制备,制备一般包括以下几个步骤：,1.,制备抗原,2.,选择实验动物,3.,动物免疫,4.,试取血进行测试效价，看看是否成功免疫,单克隆抗体制备,-5.,细胞融合,B,淋巴细胞,:,寿命短,分泌特异系性抗体,骨髓瘤细胞：,寿命长,杂交瘤细胞：,寿命长，单克隆抗体,小鼠骨髓瘤细胞,不产生,Ig,的重链和轻链,HGPRT-;TK-,与提供淋巴细胞的动物品系相同,单克隆抗体制备,-5.,细胞融合,培养骨髓瘤细胞：,选择对数生长期的细胞进行传代培养,细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐,避免细胞返祖定期用,8-AG,处理细胞,注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于,-80,或液氮及干冰中,免疫脾细胞的制备：,1,10,8,的,淋巴细胞,无菌手术,单克隆抗体制备,-5.,细胞融合,饲养细胞,细胞密度过低不利于细胞生长繁殖,常用小鼠腹腔细胞作饲养细胞，其中,MQ,还有清除死亡细胞的作用；,饲养存活一般不超过,2,周，不影响杂交瘤细胞的纯化,制备方法：用冷冻的果糖液注入小鼠的腹腔，轻揉腹部数次，吸出后的液体中即含有小鼠的腹腔细胞，其中有巨噬细胞和其他细胞。在制备饲养细胞时候，切记针头刺破动物的消化器官，否则所获得的的细胞会有严重污染。饲养细胞调至,100000/ml,，提前一天或者当天置板孔中培养。,单克隆抗体制备,-5.,细胞融合,融合剂,1962,年,Okada,首先用仙台病毒（流感病毒）诱导细胞融合成功，自发的动物细胞发生融合频率很小，但当加入病毒后，细胞融合的频率显著增大，因病毒的磷脂包膜与动物细胞膜十分相似，某些病毒的糖蛋白还有促进细胞融合的功能，仙台病毒已成为公认的细胞融合剂。,聚乙二醇（,polyethyleneglycol,，,PEG,）作为细胞融合剂，它可使邻近的细胞膜粘合，继而使细胞合并起来。,电穿孔融合术,单克隆抗体制备,-5.,细胞融合,小白鼠,脾脏细胞,B,与,NS-1,细胞,N,以,PEG,进行融合,，操作在,10 min,內完成，,随,即把,细胞,平,均,分配在,96,槽,细胞,培,养盘,中。,单克隆抗体制备,-6.,初步筛选,H,（,Hypoxanthine,）,:,次黄嘌呤,A,（,Aminopterin,）：,氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断,DNA,合成主要途径,T,（,Thymidine,）：,胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成,DNA,正常B,细胞利用,HAT培养液中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷，在,次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGRPT）和胸腺嘧啶激酶,(TK)的催化下经旁路合成DNA。,骨髓瘤,细胞是遗传基因缺陷型的细胞系，缺乏,HGRPT或TK,。,单克隆抗体制备,-6.,初步筛选,SP2/O:HGPRT-,，,TK-;,长,命,脾细胞,:,HGPRT+,，,TK+;,短命(7,天,),杂交,瘤细胞,:,HGPRT+,，,TK+;,长,命,杂交瘤细胞：,长期生长繁殖,利用淋巴细胞的,HGPRT,，将,H,合成为嘌呤碱并最终与,T,一起合成,DNA,从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息,从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力,HAT,选择作用：,淋巴细胞：,不能生长，,5,7,天死亡；,DNA,合成的主要途径被,A,阻断,骨髓瘤细胞：,不能生长，,5,7,天死亡；,HGPRT,缺乏，,DNA,合成的替代途径受阻,单克隆抗体制备,-7.,专一性筛选,筛选专一性抗体：并非所有,B,细胞都会产生我们所要的抗体，小白鼠原先就存在许多,B,细胞株对抗一般的疾病，因此要用,ELISA,方法挑选出专一性抗体,单克隆抗体制备,-8.,单株化,阳性杂交瘤细胞的克隆化培养,有限稀释法,(limiting dilution),显微操作法,(micromanipulation),FACS,法（,fluorescence activated cell sorter,）,软琼脂平板法,(soft agar method),单克隆抗体制备,-8.,单株化,有限稀释法,ELISA,所挑出來的,细胞,株，,也许,仍含有,两,群以上的,细胞,，因此要,进行单株,化。先,将该细胞株稀释,，重新平分到,96,槽細胞,培养盘,中计算,使得每槽中只含一個,细胞,，,待,其生長成群落,后,，再次以,ELISA,筛选出专一性抗体。,单克隆抗体制备,-8.,单株化,FACS,法,应用,FACS,将特异性杂交瘤细胞选出单个放入,96,孔培养板中培养,效率最高,价格昂贵,单克隆抗体制备,-8.,单株化,显微操作法,(micromanipulation),即在显微镜下，用毛细吸管挑选一个细胞进行培养。,琼脂空斑法,将软琼脂中特异空斑，再在空斑中心取细胞,杂交瘤细胞的冻存与复苏,配制方案：,杂交瘤细胞（,1,5,）,x10,6,/ml)+,细胞冻存液,(30%,40%,牛血清，,50%,60%RPMI-1640,培养液，,10%DMSO),“,慢冻,”,：,分步冷冻，,30-70,液氮,“,快融,”,：,取出立即浸入,37,40,水浴中，使其迅速融化、复苏,防止污染,避免染色体丢失,防止非分泌细胞的过度生长,防止细胞密度过高而死亡,单克隆抗体制备,-9.,抗体生产以及纯化,1),可把,挑选,出來的融合,细胞,打入小鼠腹部，,诱生肿瘤,，,然后,以,针头,收集所,产生,的腹水，通常可取得,15 mL,左右；腹水中的,抗体浓度,非常高，每,mL,可,达数,mg,。,2),把融合細胞在大型,培养,槽中,培养,，收集,培养,液上清即得,抗体,，但每,mL,只得,约数,mg,，,浓度较腹水稀,约,一千倍。最近有一,种,細胞,培养,瓶，可,产生,如腹水般,浓,度的上清，但,价格极为昂贵,(IBS Integra Bioscience:IntegraCelline),。,单克隆抗体制备,-10.,抗体性质鉴定,多克隆抗体与单克隆抗体的比较,多克隆抗体,单克隆抗体,来源,动物免疫血清、恢复期病人血清或免疫接种人群,多为鼠源性,特点,来源广泛、制备容易,纯度高、特异性强、效价高、少或无血清交叉反应、制备成本低,组成,针对不同抗原表位的抗体的混合物,针对单一表位，结构和组成高度均一，抗原特异性及同种型一致,应用,疾病的被动免疫治疗,广泛用于疾病诊断、特异性抗原或蛋白的检测和鉴定、疾病的被动免疫治疗和生物导向药物制备,缺点,特异性不高、易发生交叉反应，不易大量制备,人体应用后可导致人鼠抗体反应,抗体分子的改造和基因工程,自,1975,年,Catton,和,Milstein,等研究制造出单克隆抗体（,MAb,）技术以来，获得了迅速的发展和极为广泛的应用。但也确实存在不少难以克服的问题，如绝大多数的,Mab,是鼠源性的，对人有较强的免疫原性。如果用于人的治疗，不出,2,周就会产生人对鼠血清的免疫应答，患者体内存在的人抗鼠抗体（,human anti-mouse antibody,HAMA,），不仅降低了疗效，严重的可引起患者出现血清病。,20,世纪,80,年代中期人们开始尝试以基因工程方法改造鼠源性,McAb,亦即所谓McAb,的“人源化”。,1989,年底英国剑桥,Winter,小组与,Scripps,研究所,Lerner,小组的创造性工作。他们利用,PCR,技术克隆机体全部的抗体基因,并重组于原核表达载体中,用标记抗原就可筛选到相应抗体,当时称为组合抗体库技术。,20,世纪,90,年代初期,这一技术有了进一步发展,即将抗体基因与单链噬菌体,(M13,Fd,等,),的外壳蛋白融合并表达于噬菌体表面,以固相的抗原吸附相对应的噬菌体抗体,经多次“吸附,-,洗脱,-,扩增”即可获所需抗体。,基因工程抗体,基因工程抗体又称重组抗体,是指利用重组,DNA,及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新装配,经转染适当的受体细胞所表达的抗体分子。,目前报道的基因工程抗体很多,分类方法不一,大体可以分为三类：,第一类，完整的抗体分子,第二类，抗体分子片段,第三类，新型抗体分子,通过基因重组改良抗体性能,小分子抗体（穿透力强）,人源化抗体（降低抗原性）,双价或双特异性抗体（增强抗体的亲和力及效靶细胞的相互作用）。,抗体融合蛋白（增加蛋白的半衰期；与药物，毒性分子或酶基因融和表达，可用于肿瘤等疾病的治疗）。,细胞内抗体（用于胞内治疗或信号转导研究）。,基因工程抗体,-1.,完整的抗体分子,嵌合抗体,人源化抗体,完全人源抗体,部分已批准上市的治疗性单抗,嵌合抗体,(chimeric,antibody),由在基因水平上连接的小鼠抗体,V,区及人抗体,C,区组成。这种抗体含,75%,80%,人抗体,20%,鼠抗体,保留了原来鼠源单抗的特异性,但对人体仍具一定的免疫原性。,嵌合抗体,(chimeric,antibody),嵌合抗体,(chimeric,antibody),人源化抗体,(humanized,antibody),通过置换三个发夹状环的鼠抗体超变区（,CDR,），使构成抗原结合部位的轻重链各,3,个,CDR,区是鼠源的,其余均为人源的。该抗体对人的免疫原性大大降低,但与抗原的亲和力也有所下降。虽然目前通过选择与鼠单抗同源性大的抗体及改变骨架,(fragmentregion,Fr),上某些关键的氨基酸残基或遮蔽鼠单抗,CDR,表面的残基,(veneering),等方法,人源化抗体与抗原的亲和力只能达到原先鼠源单抗的,33%,35%,。,人源化抗体,(humanized,antibody),完全人源抗体,首先把小鼠编码,Ig,重轻链的基因剔除。制备表达人的,Ig,重轻链的转基因小鼠。上二种小鼠回交，获得只表达人,Ig,重轻链的基因的小鼠。当用抗原免疫后，小鼠可产生完全人源抗体,完全人源抗体,用人的骨髓瘤细胞直接制备全人抗体,关键点：建立好的人骨髓瘤细胞。稳定性高和融合率高,展示技术,噬菌体展示技术,噬菌体抗体展示技术,噬菌体展示抗体技术,当单株细胞,被,挑选,出來之,后,，可以,分离,出組成抗,体轻链,(L),及,重链,(H),的,mRNA,，把他們的,变异区,(VL,及,VH),逆,转录,成,cDNA,後，以,连接,片段,(Fv),接起來，並植入,噬菌体,M13,的,外壳,蛋白基因中，就可以去感染,大肠菌,，並且繁殖大量,M13,噬菌体,，就,会,在其,外壳表现,出所植入的,抗体,VL,+VH,片段，這是,抗体,最重要的抗原結合區；因為這種片段保留了抗原結合區，但沒有其他的,Fc,部份，因此可以,应用,用在很多方面。,基因工程抗体,-2.,小分子抗体,小分子抗体,第一代小分子抗体,抗原结合片段,(fragment with antigen binding,，,Fab),和重组,Fab,Fab,片段由完整轻链和重链的,VH+CH1,构成，其大小为完整抗体的,1/3,约,55KD,；,重组,Fab,是将轻、重链可变区分别与人抗体的,链和重链,CH1,重组；,Fab,基因工程构建方法及其性能,通常是保留鼠源性的,CDR,区,其余换成人源化,通过大肠杆菌以分泌表达的方式表达,L,链和,Fd,链,二者能在细菌的外周质腔中折叠成具有一定构象的,Fab,；,该,Fab,具有抗体的活性。因为其不含有,Fc,段、分子量小、结合力高、抗原性低,故在肿瘤治疗上有其优越性。目前已有多个片段药物获得,FDA,批准上市,.,Fab,的临床应用,1,）阿昔单抗,(abciximab,，,ReoPro),1994,年,12,月,FDA,批准的第一个重组,Fab,片段，该产品以血小板糖蛋白,b/a,为靶点，用以防止血小板聚集及血栓形成，作为冠状动脉导管插术时预防心肌缺血的辅助用药，取得了巨大的成功；,2,）兰尼单抗,(lucentis),：治疗黄斑变性，,2006,年获得,FDA,的批准。,3,）赛妥珠单抗,(cimzia),：克罗恩病和风湿性关节炎，,2008,年获得,FDA,的批准。,在临床研究中，,Fab,占据了临床研发抗体片段的大多数,(30/54,种,),小分子抗体,第二代小分子抗体,-,单链抗体,(single chain Fv,ScFv),ScFv,指在重链,V,区,cDNA5,端与轻链,V,区,cDNA5,端之间用一寡聚核甘酸连接,在大肠杆菌中表达成一单链多肽,并在细菌体内折叠成只由重链和轻链可变区构成的一种新型的抗体,大小仅为完整,Ig,的,1/6(,约,28KD);,含有完整抗原结合部位的最小抗体片段；,ScFV,的功能,1,）用于治疗：可进人一般抗体不能达到的部位,如蛋白偶联受体、酶活性部位和病毒表面的腔囊等；,2,）多肽接头可设计为具有特殊功能的位点：多肽接头是单链抗体的独特组成,可设计为具有特殊功能的位点：如金属赘合、连接毒素或药物等,用于影像和临床治疗；,小分子抗体,第三代小分子抗体,纳米抗体和分子识别单位,(molecular recognition unit,，,MRU),纳米抗体,主要指仅由一个重链可变区组成的单域抗体,(VHH),，其体积约为完整抗体的,1/10,，故称为纳米抗体；,1993,年,Hamers,等偶然发现骆驼体内存在一种仅具有重链的抗体，被称为重链抗体,(heavy-chain antibodies,，,HCAbs),。此后，在一些软骨鱼，如护士鲨体内也发现类似骆驼重链抗体结构的新抗原受体,(new antigen receptor,，,NAR),。,这类抗体的抗原结合位点仅由重链的可变区,VHH(variable domainof the heavy chain of HCAbs,，,VHH)单结构域形成，尽管缺失轻链可变区，却仍具有良好和广泛的抗原结合力；克隆这种抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体,(VHH),。,VHH,稳定的机制,传统抗体的,VH,和,VL,区通过疏水作用形成稳定结构，而重链抗体则通过选择性突变,VHH,胚系基因中几个功能位点，使其形成较高的亲水性表面，可在缺失,VL,条件下保持结构稳定；,纳米抗体单域的性质,1,）有高度水溶性和构象稳定性：尽管缺失轻链可变区，却仍具有良好和广泛的抗原结合力。并且由于在框架,FR2,区存在一些不同于常规抗体的亲水性氨基酸，使得,VHH,抗体在水溶液中具有良好的稳定性。在苛刻的条件中，如胃液和内脏中仍能保持抗原结合活性，为口服治疗胃肠道功能紊乱性疾病提供新的思路；,2,）纳米抗体能识别独特的抗原表位，由于具有伸展的抗原互补结合区,(CDR),以及更高的组织穿透性和更小的分子，,VHH,抗体可以结合一些常规抗体无法接近的抗原表位。可进入酶的活性部位及细菌或病毒表面受体裂缝中，可以利用其模拟药物来设计小分子酶的抑制剂、受体的激动剂或拮抗剂等；,3,）能有效地穿过血脑屏障：有望成为治疗神经性疾病和脑肿瘤的新药,VHH,胚系基因序列特性,1,）对骆驼,VHH,胚系基因序列分析发现，,VHH,与人源,VH,基因,家族序列具有较高的同源性；,2,）比较人类和骆驼,IgG,重链可变区发现，在框架,FR2,区的氨基酸组成中，有,4,个氨基酸显著不同。这,4,个氨基酸在,VH,和,VHH,中分别是,V42F,或,V42Y,，,G49E,，,L50R,和,W52G,，,利用这一特点,可以对人源抗体,VH,结构域,FR2,中的一些氨基酸进行,VHH,特征性改造,所得到的骆驼化单域,VH,抗体不仅保持原有的抗体的特异性和亲和力,而且溶解性好、稳定性好。,分子识别单位,分子识别单位,(molecular recognition unit,，,MRU),MRU,是由单个互补决定区组成的小分子抗体片段，约为完整抗体分子的,1/80,1/70,。,MRU,也具有与抗原结合的能力，且由于其穿透力强、半衰期短、显像时本