医学课件噬菌体展示技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,什么是噬菌体展示 是一项筛选技术，将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的,DNA,则位于病毒粒子内。,表型,基因型,展示肽,编码基因,使大量多肽与其,DNA,编码序列之间建立了直接联系，使各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过淘选得以快速鉴定,简介,Landmarks of phage display,1985,第一次发表噬菌体展示技术；展示多肽,Smith GP.Science.1985;228:1315-7,1988,噬菌质粒系统,1990,抗体片段的展示,1993,展示,cDNA,文库,1994/1995,研发了,phage two-hybrid,技术,1996,首次体内,in vivo,淘选试验,1998,噬菌体展示载体作为基因导入载体,1999 Combination of phage display with high-density arrays,2001 Automated phage display selection,Killing cancer cells by targeted drug-carrying phage nanomedicines,Published:3 April 2008,BMC Biotechnology,2008,8,:37 doi:10.1186/1472-6750-8-37,展示系统,Display System,Cell Based,1,、,Phage Display,2,、,Cell Surface Display,Cell Free,1,、,Ribosome Display,2,、,mRNA Display,噬菌体展示系统的分类,根据噬菌体不同,Phage,M13,f1,fdT7,T4,lamda,根据载体不同,Vector,True Phage Phagemid,根据文库不同Library,随机肽库,、,cDNA,文库,、,抗体文库,、,蛋白质文库,M13,噬菌体的组成和结构,丝状噬菌体：,M13,、,f1,和,fd,。,单链,DNA,病毒,6407 bp,。,基因组编码,11,种蛋白质，其中,5,种为结构蛋白质。与展示密切相关的有两种结构蛋白质。,DNA,在细菌内滚环复制，细菌不被裂解，但生长速度减慢，并且分泌大量噬菌体颗粒,Life Cycle of M13,pIII,蛋白结合于,E.Coli,的,F,纤毛,;,病毒,ssDNA,进入细菌的胞浆合成,dsDNA,；,以,dsDNA,为模版合成所有的病毒蛋白，且通过滚环复制合成组装病毒所需的,ssDNA,。,第一代噬菌体在感染,10,分钟后出现在培养液中（,37,）。,感染后,1,小时内平均每个细胞分泌,1000,个噬菌体。,次要衣壳蛋白,pIII,406 aa,组成，,5,个拷贝，位于噬菌体的尾部。,由三个功能区组成：,N1,穿膜区：作用于,E.coli,细胞膜上的,TolA,蛋白；与噬菌体的入侵有关。,N2,受体结合区：负责结合,F,菌毛。,CT,疏水区：组装前黏附在细菌内膜上；与噬菌体组装终止有关。,G1,、,G2:,甘氨酸片段，在感染过程中，增加各个功能域之间的灵活性。,主要衣壳蛋白,pVIII,每个病毒子含约,2700,个拷贝，约,10%,能有效地融合外源多肽或蛋白。以,pIII,融合子方式表达的多肽是低价的，而以,pVIII,融合子方式表达的多肽则是高价的（每个病毒子,200个拷贝）。,这种高价,pVIII,展示所增加的亲和力有利于筛选到亲和力非常低的配体，而低价,pIII,展示则将筛选限制在具有较高亲和力的配体上。,所有,Ph.D.,文库都是,pIII,融合方式（每个病毒子展示,5,个拷贝的外源多肽）。,pIII,蛋白展示和,pVIII,蛋白展示有什么不同,?,pVIII,展示的多肽比较小，如果太大会影响噬菌体壳蛋白的组装。,pIII,只要不影响感染，可以展示,300 aa,的多肽。,噬菌质粒能展示的蛋白已经达到,86 kDa,。,丝状噬菌体展示系统一般是在包膜蛋白,pIII,或,pVIII,的,N,端融合外源多肽。,每个病毒子含个拷贝的,pIII,蛋白，这五个蛋白都可以融合短肽而不影响噬菌体的感染力。,拷贝数不同。,噬菌体质粒,方便克隆、增强遗传稳定性,噬菌体质粒特征：,携带有欲在噬菌体上融合展示的蛋白基因，没有其他噬菌体基因。,有质粒复制起点,(322 ori),和噬菌体复制起点,(f1 ori,用于合成,ssDNA),。,有包装序列信号（,packing signal,）。,有供筛选的抗生素标记基因。,Helper phage,：提供噬菌体质粒复制、合成,ssDNA,和病毒包装所需要的所有蛋白和酶（,f1 oridefect),。,噬菌体展示技术流程,淘选的方法亲和淘选,直接包被法淘选法：,优点：简单直接。,缺点：偶尔会导致配体结合位点难以进入,可能是由于分子的立体封阻,或者是靶分子表面的部分变性而引起,液相法：先将噬菌体库在液相中与靶分子进行预结合，然后将噬菌体,-,靶分子复合物亲和捕获于亲和介质上，如：链霉亲和素包被的表面。,建库：,例子,含编码,12,肽,DNA,序列为,5,CATTCTCACTCGGCCGACGGGGC,T(NNK),12,GGGGCCGCTGGGGCCCAAACTGTTGAA 3,，其中,N,代表,A,、,T,、,C,、,G,四种碱基，,K,代表,G,、,T,两种碱基，,(NNK)12,为编码随机,12,肽部分，划线部分含有,Bgl,识别序列。,扩增,-,嵌合,-,噬菌体扩增,亲和淘选,噬菌体肽库与靶分子相互作用,洗涤去未结合的或非特异性结合的噬菌体,将特异性结合的噬菌体洗脱下来,三轮淘选后，克隆测序,噬菌体展示的应用,抗原表位分析,制备特异性抗体,制备疫苗、多价疫苗,构建新型的生物催化剂,如,Renet al(1997),将,T4 DNA,连接酶展示于,T4,噬菌体，所表达的融合蛋白能够高效连接黏性或者平末端。,有可能把催化某一代谢途径的多种酶展示到噬菌体上，制造人工的多酶复合体。或者把成百上千个酶分子的活性位点展示到同一个噬菌体颗粒上，制造,superenzyme,。,筛选酶抑制剂是寻找抑制酶活性肽段的理想工具。,Dennis,从肽库中筛选到非竞争性地抑制,F VIIa,活性的肽段。,噬菌体展示的应用,蛋白质蛋白质相互作用,噬菌体,cDNA,文库与芯片相结合,(a),合成噬菌体,cDNA,文库。,(b),生物淘选。,(c),铺板，挑克隆入微孔板，为制备芯片做准备。,噬菌体展示的应用,应用举例,用病人,IgE,血清对,6,种不同的,cDNA,文库淘选，,5,轮后，挑出,38,000,个克隆，鉴别了,233,种蛋白，其中,47,种为已知，,186,种是新的过敏源。,烟曲霉,(Aspergillus fumigatus),已成为临床上仅次于白色念珠菌的一种重要的条件致病真菌。,草本枝孢,(,小麦黑霉病菌,)Cladosporium herbarum,鸡腿蘑（,Coprinus comatus,）,皮屑牙胞菌,(Malassezia furfur),花生和人肺组织,Crameri,R.,et al.,(2001)Tapping allergen repertoires by advanced,cloning technologies.,Int.Arch.Allergy Immunol.,124,4347,噬菌体表面展示肽库优缺点,优点：,M13,无需体外包装,电转化效率高,库容量大,2.8,10,9,M13,噬菌体纯化步骤简单，可加速淘选进程,可避免细胞蛋白的污染,Any ligand(natural or synthetic),随机肽库,体内筛选器官特异性多肽,缺点：,仅适合展示小的多肽,(,=20,氨基酸,),载体容量,1 kb,；且有序列依赖性,不能筛选,Natural ligand(T7 cDNA,文库,),不能筛选,DNA-,RNA-,结合肽,(,用,T7,载体文库可以,),THANS！,Elements,