PCR技术与医学应用(中山大学).ppt

单击此处编辑标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,PCR技术及其应用,分子生物学与临床,中 山 大 学,（）,目 录,PCR的概念,PCR技术的创建,PCR的原理,PCR的反应体系和方法,PCR的类型和应用,多聚酶链式反应,（PCR：Polymerase Chain Reaction),Polymerase:,DNA聚合酶,基因组DNA,引物,DNA聚合酶,DNA片段体外扩增,PCR技术的创建,Kary B.Mullis（穆利斯（美）,Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。,1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。,1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术,1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,Kary B.Mullis（1944）,,三篇重要论文,The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction(Scientific American,1990,262(4):56-61,64-5),Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase(Science,1988,239(4839):487-91,),Specific Synthesis of DNA In Vitro via a Polymerase Catalyzed Chain Reaction(Methods in Enzymology,1987,155:335-50),生物样品,DNA片段,基因诊断,基因治疗,基因工程产品,法医学检测,人类学研究,PCR技术诞生所依赖的社会需求和研究需要,基因组DNA,获取特定DNA片段,扩增特定DNA片段,限制性内切酶裂解,基因组DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,基因组DNA文库,DNA文库,20kB fragments,插入噬菌体载体,细菌扩增,裂解变性,显影,从基因组文库中筛选目的基因,probe,放射性核素,标记,转印,DNA克隆,目的基因,载体,复制子,宿主细胞,扩增,扩增,提取DNA分子,DNA聚合酶,引物,引物,M13噬菌体,Sanger的测序技术,引物,DNA聚合酶,1977年,引物,引物,Mullis的构思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,特定DNA片段,1983年,94,变性,50-65,退火,XX,延伸,94,55,37,Taq,DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),温度,(,),40 50 60 70 80 90 100,100,80,60,40,20,1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术,72,94,55,PCR循环,PCR技术的原理,1 PCR技术的基本原理,无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过,高温变性,、,低温退火,和,中温延伸,三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终,使基因放大了数百万倍,;扩增了特异区段的DNA带,。,体内DNA的复制,DNA聚合酶,dNTP,解旋酶类,引物,复习,5,3,加热,变 性,复性,复温,DNA的变性和复性,加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。,解除变性的条件后,变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性,也叫退火。,PCR扩增原理,引物,延伸,延伸,5,5,3,3,变性、退火,变性、退火,2 PCR技术的特点,1）高度的灵敏性,30轮循环,扩增量达2,30,个拷贝（10,9,拷贝）,PCR产物每轮循环增加一倍,2）特异性,引物,引物,引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。,引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。,引物设计：,（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。,（2）引物长度以15-40 bp为宜。,（3）,碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。,（4）引物内部避免形成二级结构。,（5）两引物间避免有互补序列。,（6）引物,3端,为,关键碱基,；5端无严格限制。,3,5,3,5,限制性内切酶的识别序列,启动子序列,定点突变,探针标记,3）操作简便易行,PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1g基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。,通常的DNA 扩增法是分子克隆法,首先要构建含有目的的基因的载体,然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时间。,目的基因,载体,复制子,宿主细胞,扩增,扩增,提取DNA分子,4）用途广泛,生命学科,医学工程,遗传工程,疾病诊断,法医学,考古学,PCR的反应体系和方法,PCR管加热使模板变性,退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温(72),在,Tap多聚酶,的作用下,以,dNTP,为原料,以,引物,为复制的起点,合成新链。,如此重复改变反应温度,即,高温变性、低温退火和中温延伸,三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过,30次循环,最终使基因放大了数百万倍;将扩增产物进行电泳经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。,总体积,50-100,l,Buffer,缓冲液,dNTP,原料,Primer,引物,DNA分子,模板,Taq酶,DNA聚合酶,1 反应体系,PCR技术的基本过程(1),模板DNA,dNTP,引物,Buffer,预变性,模板DNA,dNTP,引物,Buffer,TaqDNA聚合酶,94,o,C5,2 基本过程,PCR技术的基本过程(2),Taq 酶,模板DNA,dNTP,引物,Buffer,循环仪,94,55,72,Taq 酶,模板DNA,dNTP,引物,Buffer,72 57 min,循环2535次,琼脂糖凝胶电泳,PCR技术的基本过程(3),1）PCR反应成分,（1）,模板,单、双链DNA均可。,不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。,一般100ng DNA模板/100,L。,模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,3 PCR反应条件,（2）引物浓度,0.1-0.5,mol/L,浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。,（3）Taq,DNA聚合酶,（thermus aquaticus),0.5-2.5 U/50,l,酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。,（4）dNTP,dNTP浓度取决于扩增片段的长度,四种dNTP浓度应相等,浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量,dNTP可与Mg,2+,结合,使游离的Mg,2+,浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。,（5）Mg,2+,Mg,2+,是DNA聚合酶的激活剂。,0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。,Mg,2+,浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg,2+,过高影响反应特异性。,Mg,2+,可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg,2+,浓度。,2）循环参数,变性,使双链,DNA,解链为单链,94,o,C 20-30,秒,(2),退火,温度由引物长度和,GC,含量决定。,增加温度能减少引物与模板的非特异性结合,;,降低温度可增加反应的灵敏性。,3）延伸,70-75,一般为72,延伸时间由扩增片段长度决定,（4）循环次数,主要取决于模版DNA的浓度,一般为25-35次,次数过多：扩增效率降低,错误掺入率增加,经典循环参数（500bp以内）,94 30s,55 45s,72 1min,94 5min,30次,72 7min,42 forever,1）不对称PCR,目的：扩增产生特异长度的,单链DNA,。,方法：采用,两种不同浓度的引物,。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。,用途：制备核酸序列测定的模板,制备杂交探针,基因组DNA结构功能的研究,PCR的类型,高浓度引物,低浓度引物,2)反向PCR,(reverse PCR),是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。,可对,未知序列,扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。,已知序列,未知序列,未知序列,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,3）多重PCR,（复合PCR）,用于检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,引物,1,2,3,4,1,2,3,4,DMD：人类肌营养不良基因,A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子819缺失,B：病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者,C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式,多重PCR检测DMD基因缺失,4）LP-PCR,（Labelled primers),利用同位素、荧光素等对引物进行标记,用以直观地检测目的基因。,特别适合大量临床标本的基因诊断,可同时检测多种基因成分,病毒1 病毒2 病毒 3 病毒4,标记引物,观察,PCR产物,5）锚定PCR（anchored PCR,A-PCR）,PCR的局限：需了解靶基因片段两测的序列,对于未知序列和具有不同末端序列怎么办？,（固定化PCR）,VH,CH1,CH1,CH2,CH2,CH3,CH3,VH,VL,VL,CL,CL,cDNA,末端核酸转移酶,3GGGG,5,CCCC 锚定引物,3GGGG,5,CCCC,3GGGG,CCCC,锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增,6）PCR固相分析法,模板,生物素化引物,PCR扩增,探针,亲和固相介质,检测探针信号,可用于基因芯片的制作,7）原位,原位聚合酶链式反应（In Still PCR,IsPCR）是由Haase等于1990年首创。它是,利用完整的细胞作为一个微小的反应体系,来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。,直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行,细胞内定位。,适用于检测病理切片中含量较少的靶序列,原位PCR的作用,既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH）,但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下,该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列,敏感度很高,但却未能与细胞形态学研究相结合。,ISPCR则可把这两者结合起来,成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。,操作步骤,1.细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入,2.PCR扩增细胞内目的片段,3.原位杂交检测扩增产物,A.阳性对照,B.阴性对照,C.原位检测mRNA表达,8）,逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,基因,mRNA,蛋白质多肽链,9),荧光定量,PCR,（,real-time PCR),通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对,PCR,产物进行标 记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。,荧光定量,PCR,仪,光定量,PCR,仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的,PCR,仪,通常配有电脑系统及相应的分析软件。,荧光标记,荧光定量,PCR,标记方法,内掺式染料,SYBR Green,I,序列特异性探针,Taqman,Molecular Beacons,Dual Probes(,FRET),引物特异性探针,Amplifluor,(,Intergen,),5,3,5,3,SG,Excitation,SG,SG,SG,SG,Emission,SYBR-Green I,5,3,5,3,SG,SG,SG,SG,SG,Excitation,Emission,SYBR-Green I,Taqman探针3端Q荧光分子能够吸收5端R荧光分子发出的荧光,因此,正常情况下该探针检测不到5端荧光分子发出的荧光,只能检测到3端荧光分子的荧光信号,但当溶液中有PCR 产物(模板)时,探针与模板退火,即产生了适合于核酸外切酶活性的底物,从而激活Taq 酶的5外切酶活性,将探针5端连接的R荧光分子从探针上切割下来,破坏了两个荧光分子间的FRET,从而发出荧光,切割的R荧光分子数与PCR 产物的数量成比例,因此,根据PCR 反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量,荧光能量传递技术(fluorescence resonance energy transfer,FRET),Oligo 1:Fluorescein,Oligo 2:LC Red 640,Excitation,Emission,Transfer,荧光共振能量传递（FRET,Probe）,R,Q,5,3,5,3,5,3,5,3,Excitation,R,Q,Q,R,Q,R,Excitation,双标记探针（Taqman Probe）,R,Q,Excitation,R,Q,Q,R,Excitation,Emission,分子信标,（Molecular Beacon Probe）,引物特异性探针（Amplisenor,Probe）,5,3,5,3,5,3,5,3,3,R,Q,5,R,Q,R,Q,3,5,Q,R,R,R,Emission,Excitation,Q,R,引物特异性探针（Amplifluor,Probe）,荧光定量实时,PCR,与普通,PCR,的比较,实时在线监控,对样品扩增的整个过程进行实时监控,能够实时地观察到产物的增加,直观地看到反应的对数期,降低反应的非特异性,使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合,提高了,PCR,反应,的特异性,增加定量的精确性,全程监控,准确的算法进行定量,结果分析更加快捷方便,无需跑胶,全新4通道实时荧光定量PCR仪,普通梯度PCR仪,PCR技术的应用,1)基因克隆,重组DNA,质粒DNA,基因片段,大肠杆菌,胰岛素,重组体,+,胰岛素,基因,基因工程产品,5,5,Bam H I,Bam H I,Bam H I,Bam H I,GTCC,GGAC,CCTG,CAGG,GTCC,GGAC,CCTGCAGG,CCTG,GGAC,GTCC,CAGG,质粒DNA,目的基因,限制性核酸内切酶,2)基因检测,A,内源性病变基因,正常人,A,病 人,病原微生物基因,正常人 (-),病 人 (+),遗传病的诊断,基因缺失、插入或置换等,地中海贫血,珠蛋白链合成不平衡,A,正常人,病 人,正常,病人,ASO探针法,A,C,T,G,ASO探针,正常,病人,PCR-ASO检测基因点突变:主是利用PCR技术扩增靶基因的适当片段,然后用人工合成的含突变位点的标记寡核苷酸探针杂交,探针杂交,NC膜,探针,正常人,突变纯合子,突变杂合子,PCR-RFLP法：,限制性内切酶,恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）,Ras基因,突变,限制性内切酶,正常,突变,电泳,HLA系统基因分型,PCR-RFLP法,PCR-SSO法,PCR-SSCP,PCR-SSP,3)基因配型,PCR-SSP,1 2 3 4 5 6 7 8,PCR,1 2 3 4 5 6 7 8,引物特异性,（序列特异性引物-PCR技术）,4）基因,鉴定,女性,男性,Y引物,PCR,男性 女性,法医学分析,个体识别、亲缘鉴定,方法：PCR-RFLP,DNA遗传指纹,PCR-ASO,PCR-VNTR多态性,PCR-SSCP,线粒体DNA测序,PCR-VNTR多态性检测,PCR；电泳检测,（VNTR：,数目可变的串联重复序列）,父 父 子 母,现 嫌1 嫌2 嫌3,思考题:,1)从PCR的基本原理和特点,论述其应用价值.,