色谱分析(液相).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,高效液相色谱分析,High Performence Liquid Chromatography HPLC,气相色谱法,适用于分析,相对分子质量较小、沸点较低、热稳定性好的物质，这些物质仅占有机化合物总数的,25%,30%,。,对于,热稳定性差、相对分子质量大,(400,以上,)(,如生化试样,),、沸点高的物质，,占有机物总量的,75%-80%,。,宜用高效液相色谱法进行分析。,高效液相色谱法是,用液体作为流动相,的色谱法。,现代高效液相色谱,经典液相色谱,经典液相色谱与,高效,液相色谱的异同,H=,A,+Cu,现代,高效液相色谱法,具有下列,特点,：,(1),高压：,液相色谱法使用液体作为流动相,(,简称载液,),，,液体流过色谱柱时，所遇到的阻力很大，为了使载液迅速通过色谱柱，必须对载液施加高压。,高效液相色谱法工作压力高达,20MPa,30MPa,。,(2),高速：,高效液相色谱法的分析时间,较经典的液相色谱所需的时间要少得多，,分离一个样品只需几分钟至几十分钟，仅为经典液相色谱的几十分之一。,(3),高效：,一般气相色谱法的色谱往是数千塔板米，高效液相色谱法的,塔板数可达约,3,万塔板,/,米，使分离效率大大提高。,(4),高灵敏度,：,紫外光度检测器,的检测限可达,10,9,g,，,荧光检测器,的灵敏度可达,10,11,g,。,(,电化学检测器,蒸发光散射检测器,),五个部分,：,高压输液系统、进样系统、色谱柱、检测系统、记录仪。,（一）高效液相色谱仪,离子色谱的基本流程图,1.,高压输液系统,高压输液系统由贮液器、高压泵、梯度淋洗装置组成，核心部分是,高压泵,。,高效液相色谱的,流动相,应满足如列要求,：,(1),应具有足够的纯度，一般选用,色谱纯试剂,。,(2),流动相与固定液应互不相溶。,(3),流动相对试样各组分应有适当的溶解度。,(4),粘度小,。,(),(5),检测器对流动相不产生响应,。,高压泵,高效液相色谱仪的重要组成部分,，应具备如下,性能,:,（,1,）有足够的输出压力，使,流动相能顺利地通过颗粒很细的色谱柱，通常在,14.7MPa,44MPa,之间；,（,2,）输出流量恒定无脉动，其流量精度在,1%,2%,之间；,（,3,）输出流动相的流量范围广且流速可调，对分析仪器，一般为,3mL/min,；制备仪器为,10,20mL/min,。,梯度淋洗装置,应用梯度淋洗，可以提高分离效果。,梯度洗提法：,在分离的过程中，应用梯度淋洗装置，,按一定的程序改变两种或两种以上不同极性的溶剂之间的比例，使流动相的成分和极性产生相应的变化，,从而改变复杂物质中不同极性的组分的相对保留值，,提高分离效果，加快分析速度,。,2.,进样装置,注射器进样装置,优点：,可以任意改变进样体积，注射快速，不易造成峰扩张,缺点：,重现性较差，试液容易渗漏,高压定量进样阀,(,六通阀,),由阀芯、阀体、定量管组成。,优点：,进样量的可变范围大，耐高压，易于自动化,缺点：,容易造成色谱峰扩张,开始分析,废液,样品,淋洗液,至分离柱,进样阀,样品,装样,废液,淋洗液,至分离柱,六通阀,定量环进样,（）,（,）,样品环,3.,色谱柱,常用内壁抛光过的,不锈钢管,制成,标准柱型：,内径为,4.6mm,或,3.9mm,，,长为,15cm,30cm,的直形不锈钢柱。,发展趋势是,减小填料粒度,和,采用,化学键合固定相,以提高柱效。,4.,检测器,应具有：,灵敏度高、噪音低、线性范围宽、定量准确、适应范围广等特点，同时还应该对温度和载液流速的变化不敏感。,可用的检测器有：,紫外、折光、电导、荧光、电化学检测器,等,常用的检测器有：紫外,-,可见光度检测器和差示折光检测器,紫外,-,可见光度检测器,(,传统的,),一种小型的装有流动池的双光束光度计,紫外,-,可见光度检测器灵敏度很高，检测限可达,10,-9,g,mL,-1,优点：这种检测器对温度和流速不敏感，适宜于梯度淋洗,缺点：不能用于对紫外,-,可见光完全不吸收的试样的检测,光电二极管阵列检测器示意图,Diode-Array Absorption Spectra of the eluent from a mixture of three steroids taken at 5-second intervals,差示折光检测器,(,无紫外吸收的可测,),一种浓度型检测器，是通过连续测定测量池中,溶液折射率的变化,来测定组分的浓度。,优点：,凡与流动相折射率不同的组分，都可以用差示折光检测器来检测，所以差示折光检测器是一种,通用型检测器,。差示折光检测器的灵敏度可达,10,-7,g,mL,-1,(,灵敏度比紫外低,),缺点：,对温度和流速的波动很敏感,灵敏度低,.,Differential,Refractive-Index Detector,(,示差折光检测器）,Fluorescence Detector,荧光检测器,Electrochemical Detector,电化学检测器,Conductivity Detector,电导检测器,离子色谱检测器,新的,HPLC,检测器,Pulsed amperometric detection(PAD),-,脉冲安培电化学检测,Evaporative light-scattering detection(ELSD),-,蒸发光散射检测（通用型）,Performances of HPLC Detectors,（二）高效液相色谱法中影响分离的因素及操作条件的选择,塔板理论,:,速率理论：,H=A+C,u,*,选择颗粒较小的均匀填料,*采用化学键合固定相,*采用粘度小的流动相,*降低流速,流动相流速及填料粒径对柱效的影响,Effect of mobile phase velocity of the column efficiency,在,HPLC,中，是否可以通过降低,u,有效提高柱效？,液,-,固色谱法,液,液色谱法,离子交换色谱法,凝胶色谱法,（三）高效液相色谱法的分类及其分离原理,流动相,LIQUID,Liquid-Liquid,Chromatography,(Partition,),Liquid-Solid,Chromatogr,aphy,(Adsorption,),Liquid,Solid,Normal,Phase,Reverse Phase,Normal Phase,Reverse Phase,Mobile,Phase,-,Nonpolar,Stationary phase,-,Polar,Mobile Phase,-,Polar,Stationary phase,-,Nonpolar,分离模式,固定相,Types of Liquid Chromatography,对流动相的基本要求：,流动相与固定相互不相溶,试样要能够溶于流动相中,流动相粘度较小,流动相不能影响试样的检测,常用的流动相：水、乙腈、甲醇、乙酸乙酯、乙醚、甲苯、正己烷、环己烷等。,在各类,LC,中，,流动相分子（离子）与组分分子（离子）共同竞争固定相,!,流动相条件的选择很重要,!,1.,液,-,固色谱法（液,-,固,吸附,色谱法）,固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的,吸附作用,不同来进行分配的。,常用的液,-,固色谱吸附剂：,薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺,等。,一般规律：,对于固定相而言，,非极性分子,与,极性吸附剂,之间的作用力很弱，,分配比,k,较小,，,保留时间较短；,但,极性分子,与,极性吸附剂,之间的作用力很强，,分配比,k,大，保留时间长。,Liquid Solid Chromatography,(LSC),Si-O-H,d-d+,Silica Gel,30,m,Si-OH,Hexane,OH,C-CH,3,CH,3,CH,3,-C,CH,3,CH,3,OH,OH,CH,3,CH,3,应用,:,常用于分离非极性、弱极性化合物，含有不同类型或不同数量官能团的有机化合物，以及有机化合物的不同异构体。,吸附,重点要考虑洗脱,！,液,-,液色谱法的作用机制,(,分配色谱,),溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快。,液,-,液色谱法与液,-,液萃取法的基本原理相同,K,值大的组分，保留时间长，后流出色谱柱。,2.,液,-,液色谱法（液,-,液,分配,色谱法）,将,液体固定液,涂渍在,担体,上作为固定相,固定液,Normal Phase LLC,Reverse Phase LLC,NCCH,3,CH,2,OCH,2,CH,2,CN(Normal),CH,3,(CH,2,),16,CH,3,(Reverse),Liquid Liquid Chromatography,(LLC),重点要考虑保留,！,正相色谱和反相色谱,正相分配色谱,用,极性物质作固定相，非极性溶剂,(,如苯、正己烷等,),作流动相；,反相分配色谱,用,非极性物质作固定相,(,C18,烷,ODS),，,极性溶剂,(,如水、甲醇、乙腈等,),作流动相；,正相色谱是固定液的极性大于流动相的极性，而反相色谱是固定相的极性小于流动相的极性。,正相色谱适宜于分离极性化合物，,反相色谱则适宜于分离非极性或弱极性化合物。,非极性的十八烷,(ODS),化学键合固定相,在硅胶表面利用硅烷化反应,：,流动相,TBAOHACNH,2,O,样品,Y,+,X,-,固定相,TBA,+,OH,-,Y,+,X,-,Y,+,X,-,(,TBA,+,X,-,),(,TBA,+,X,-,),(,TBA,+,X,-,),(,TBA,+,X,-,),TBA,+,OH,-,ACN,ACN,ACN,ACN,ACN,ACN,ACN,TBA,+,OH,-,TBA,+,OH,-,疏水相,亲水相,反相离子对,HPLC,分离机理,Y,+,OH,-,离子对试剂：,TBAOH,（,氢氧化四丁铵）,化学键合固定相,优点：,化学键合固定相无液坑，,液层薄,，,传质速度快，无固定液的流失,固定液上可以,结合不同的官能团,，改善分离效能,固定液,不会溶于流动相,，有利于进行梯度淋洗,液,-,液色谱法的应用,(,固定液选择范围广,),液,-,液色谱法既能分离极性化合物，又能分离非极性化合物，,如烷烃、烯烃、芳烃、稠环、染料、留族等化合物。化合物中取代基的数目或性质不同，或化合物的相对分子质量不同，均可以用液,-,液色谱进行分离。,3.Ion-Exchange Chromatography(IEC),SO,3,-,Na,+,样品中的各组分离子竞争,固定相（离子交换树脂）,活性位点,!,（静电作用）,Ion-Exchange Chromatography of Amino Acids,Gel-Permeation Chromatography(GPC)or Size Exclusion Chromatography(SEC),gel particle,buffer,protein molecule,salt ions,4.,凝胶渗透,(,排阻,),色谱,靠固定相的孔径分离不同分子质量（尺寸）的物质！,（四）色谱分离方法的选择,1.,气相、高效液相色谱法的应用范围,气相色谱法适用于分析相对分子质量较小，容易挥发成气体的物质。,气相色谱法控制温度可达,300,，热稳定性差的物质在此温度下将发生分解但高沸点物质在此温度下也不能完全汽化。,高沸点、热稳定性差的有机化合物、以及相对分子质量大,(,大于,400),的有机物,(,约占有机物总数的,70%,80%),，,均不宜应用气相色谱法进行分析，但可以应用高效液相色谱法进行分析。,高效液相色谱法,在常温下进行分离与分析，不会导致被测物质的热分解，,其流动相是液体，所以只要试样能制备成溶液，原则上都可以用高效液相色谱法分离与分析，,如离子型化合物、不稳定天然产物以及氨基酸、蛋白质等高分子化合物均可用高效液相色谱法获得较好的分离效果。,2.,色谱分离方法的选择,选择的基本依据,（,1,）相对分子质量的大小：,对于相对分子质量在,200,以下、易挥发、热稳定性好的化合物，可采用气相色谱法；,相对分子质量在,200,2000,的化合物，可用液,-,固色谱法、液,-,液色谱法、离子交换色谱法等液相色谱法。,相对分子质量大于,2000,的试样，适宜用凝胶色谱法进行分离。,（,2,）试样的溶解性,能迅速,溶于水或甲醇等极性溶剂,的样品，可采用,反相液,-,液色谱法,；,若试样全部或大部分能,溶于,HCl,或,NaOH,溶液，表示试样属于离子型化合物，可采用,离子交换色谱法,来分离；,溶于非水溶性溶剂,(,如己烷、异辛烷、苯、甲苯等烃类,),的试样，选用常规的,液,-,液色谱,(,正相色谱,),法和吸附色谱法；,Temporal,course,离子交,换,分离机理,阴离子交,换树,脂(乳胶型,）,m,阳离子交换树脂,(接枝型),分离阴离子,色谱柱,：,IonPac,AG12A/AS12A,检测器,：,2.7,mM Na,2,CO,3,0.3mM NaHCO,3,流速,：,1.2,mL/min,检测器,：,电导,(,自再生抑制循环模式,),0,2,4,6,8,10,12,14,16,Retention time(min),0,8,m,S,F,-,NO,3,-,SO,4,2-,Cl,-,NO,2,-,Br,-,HPO,4,2-,色谱柱,:,IonPac CS12A,CG12A,流动相,:,20,mM,甲磺酸,流速,:,1.0,mL/min,检测器,:,电导,（,自再生循环模式,),分离阳离子,0,2,4,6,8,10,12,14,Retention time(min),0,1,2,3,4,Na,+,NH,4,+,K,+,Mg,2+,Ca,2+,S,