小牛肠碱性磷酸酶的提纯及比活力测定.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验六,小牛肠碱性磷酸酶的提纯及比活力测定,实验目的,掌握小牛肠碱性磷酸酶的提取及酶活力测定的原理和方法,酶活力：,在最适反应条件（,25,）下，每分钟内催化,1,mol,底物转化为产物所需的酶量为一个,酶活力单位，即,1U=1,mol/min,。,酶的比活力：,代表酶的,纯度,，用每,mg,蛋白质所含的酶活力单位数表示。,比活力,=,活力（,U,）,/,蛋白（,mg,）,=,总活力（,U,）,/,总蛋白（,mg,）,酶活力的测定方法：,分光光度法；荧光法；同位素测定法；电化学法,基本知识,蛋白质（酶）的分离纯化,根据蛋白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等。,性 质 方 法,分子大小 透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤,溶解度 等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀,电荷 电泳、离子交换层析,吸附性质 吸附层析（羟基磷灰石层析、疏水层析）,配体分子 亲和层析的生物亲和力,1,、粗分级分离,主要是利用,盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀,等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的,特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质,，但分辨率低。,（,1,）盐析,向蛋白质溶液中加入大量的中性盐,(NH,4,),2,SO,4,，,Na,2,SO,4,，使蛋白质脱去,水化层,而聚集沉淀，这种现象称为,盐析,。,盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，使水的活度降低，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。,分段盐析,不同蛋白分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不同，因此调节盐浓度，可使不同的蛋白质分别沉淀，如：,血清,球蛋白,清蛋白,(NH,4,),2,SO,4,50%,饱和度,完全饱和,析出,析出,常用的盐析剂是硫酸铵，因为它的盐析能力强，在水中的溶解度大，价格便宜，浓度高时也不会引起蛋白质活性丧失。盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有活性。,透析,是将含有小分子杂质的蛋白质溶液装在具半透膜（玻璃纸、火绵纸等）性质的透析袋里，放在蒸馏水中进行透析，可不断更换蒸馏水直至杂质被除去。,透析袋,蛋白质溶液,蒸馏水,蛋白质用盐析方法沉淀分离后，还需要脱盐来进一步提纯。脱盐常用,透析法,。,（,2,）等电点沉淀,蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数量有关，随溶液,pH,变化而变化。在溶液,pH,值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。,不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节溶液,pH,到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。,（,3,）有机溶剂法,与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。,原因？,降低水的介电常数,，使蛋白质分子表面可解离基团的,离子化程度减弱，水化程度降低,，促进了蛋白质分子的聚集沉淀。,极性有机溶剂与蛋白质,争夺水化水,，而使蛋白质分子沉淀。,常温下，有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而且伴随着变性。因此，先将有机溶剂冷却，然后不断搅拌、逐渐加入蛋白质溶液中，以防局部浓度过高，解决变性问题。,不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓度的有机溶剂分离不同的蛋白质。,2,、细分级分离,一般蛋白质样品经粗制分级后，进一步提纯，通常使用高分辨率的柱层析及电泳方法。,常用的柱层析方法有,分子筛层析、离子交换层析、疏水吸附层析、亲和层析,。,常用的电泳方法有,聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳,。,另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。,3,、酶的活力测定,在酶的制备过程中，每一步骤都应测定酶的总活力和比活力，以了解经过某一步骤后酶的回收率、纯化倍数，从而决定这一步的取舍。,总活力,=,活力单位,/ml,酶液,总体积（,ml,）,比活力,=,总活力单位数,/,总蛋白（,mg,）,纯化倍数,=,每次比活力,/,第一次比活力,回收率（产率）,=,（每次总活力,/,第一次总活力）,100%,实验原理,小牛肠碱性磷酸酶分子量为,145000,，等电点为,5.7,。在体外可催化底物,对硝基苯磷酸二钠,生成,对硝基苯酚,，后者在,405nm,光波长下有最大吸收，通过测定吸收值的变化率，即可测定碱性磷酸酶的活力。,实验器材：,新鲜小牛肠、匀浆机、离心管、剪刀、载玻片、离心机、滤布、,762,型分光光度计。,试剂：,正丁醇、丙酮（,-20,预冷），,1mol/L HAc,，,1mol/L NaOH,，硫酸铵，对硝基苯磷酸二钠。,平衡缓冲液,：,0.01mol/L Tris-HCl,（,pH8.0,），含,1.010,-3,mol/L MgCl,2,和,1.010,-5,mol/L ZnCl,2,。,底物缓冲液,：,1mol/L,二已醇胺,-,盐酸缓冲液（,pH9.8,），含,0.510,-3,mol/L MgCl,2,。,酶的底物溶液,：用底物缓冲液配制,1510,-3,mol/L,对硝基苯磷酸二钠溶液。,实验步骤,1,、取新鲜小牛肠，用剪刀纵向剖开，用载玻片刮小肠粘膜到不锈钢盘一角。,2,、所有组都倒入匀浆机里，加,1.5,倍体积冷蒸馏水（实为每组涮洗水），高速匀浆,15s,，停,5s,，重复,25,次，缓慢加入,1,倍体积冷,正丁醇,（总体积），高速匀浆,15s,，停,5s,，重复,25,次，于,100ml,离心管，在,4,下，,10000rpm,离心,15min,。,(,管体积,70%,，离心前一定注意配平,),4,、用滤布过滤除杂质，用分液漏斗取下层水相，用,1mol/L HAc,调,pH,到,4.9,，,10000rpm,离心,10min,，除沉淀。,5,、上清,ml,用,1mol/L NaOH,调,pH,至,6.5,，称硫酸铵,g,至,5%,，加入离心管，加,0.47,倍体积（,ml,）,冰冷丙酮,，混匀，,4,放置,30min,以上。,6,、,4,，,10000rpm,离心,10min,，除沉淀，上清（测酶活）加入,1.07,倍体积（,ml,）冷丙酮，,4,放置,30min,以上。,7,、,4,，,10000rpm,离心,10min,，其上清，将沉淀溶于,2ml,平衡缓冲液，（,向溶液中加入硫酸铵至,35%,混匀，,4,，,8000rpm,离心,10min,，除沉淀。,8,、上清加入硫酸铵至,65%,混匀，,4,，,8000rpm,离心,10min,，沉淀溶于,2ml,平衡缓冲液。,）,9,、将称量溶解好的酶的底物（对硝基苯磷酸二钠）,37,保温,5min,，取,底物,1.5ml,加入玻璃比色杯（小型）中，加入,30,l,酶样品液，立即在,405nm,波长下，按,Start,键，设定,60,秒，画出酶动力学曲线。其中的酶样品液要测量蛋白质浓度，计算比酶活力单位。,酶比活力（,U/mg,）,=,（,A/t,）,V,R,D/,E,405,V,E,c L,A,：,405nm,波长下吸光度的变化,t,：时间，；,V,R,：反应液的体积，,1.5ml,；,D,：稀释倍数；,E,405,：,405nm,波长下对硝基苯酚的摩尔吸收系数，,18.3,；,V,E,：所加酶液体积；,c,：酶液浓度；,L,，比色皿光程，,0.5,。,10,、蛋白质的测定：,将酶样稀释,50,倍，取,0.1ml,，加,5ml,考马斯亮蓝，在,595nm,波长下测吸光值，确定蛋白浓度。,1,、小牛肠碱性磷酸酶的分子量是多少？等电点是多少？,分子量为,145000,，等电点为,5.7,2,、何谓酶活力（单位）？,在最适反应条件（,25,）下，每分钟内催化,1,mol,底物转化为产物所需的酶量为一个酶活力单位，即,1U=1,mol/min,。,3,、何谓盐析？盐溶？,蛋白质溶液中加入大量的中性盐,(NH,4,),2,SO,4,，,Na,2,SO,4,，,使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀，这种现象称为,盐析,。,蛋白质溶液中加入少量的中性盐,(NH,4,),2,SO,4,，,Na,2,SO,4,，会增加蛋白质与水分子的作用，从而使蛋白质在水中的溶解度增大，这种现象称为,盐溶,。,思考题,4,、与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低，为什么？,降低水的介电常数，使蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了蛋白质分子的聚集沉淀。,极性有机溶剂与蛋白质争夺水化水，而使蛋白质分子沉淀。,5,、为什么先将有机溶剂冷却，然后边搅拌边逐渐加入到蛋白质溶液中？,常温下，有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而且伴随着变性。因此，先将有机溶剂冷却，然后不断搅拌、逐渐加入蛋白质溶液中，以防局部浓度过高，解决变性问题。,6,、本实验中正丁醇的作用是什么？,小牛肠碱性磷酸酶为膜结合酶，具有典型的两亲性质，其疏水端锚定在微绒毛膜上。匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。,结 束！,