动物肝脏组织基因组DNA的提取(高盐法)课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,核酸的分类,DNA,(脱氧核糖核酸),主要存在于细胞核的染色体中。,核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。,RNA,（核糖核酸）,存在于细胞质中，如mRNA,rRNA,tRNA等。,除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。,1,核酸的理化性质,在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在。,溶于水，不溶于乙醇,、,氯仿等有机溶剂。在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。,在强大离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来。,2,浓盐法,：利用RNA和DNA在不同盐浓度溶液中的溶解度不同将二者分离。,离子去污剂法,：利用SDS、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）等去污剂使蛋白质变性，直接从生物材料中提取DNA。,苯酚抽提法,：苯酚既是蛋白变性剂，又能抑制DNase的降解。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA连接键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。,基因组DNA的提取方法,3,核酸提取的主要步骤,破碎细胞,：研磨、组织匀浆、超声、冻融；异硫氰酸胍、碱裂解；酶解（溶菌酶除去与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子,：酚/氯仿抽提、蛋白变性剂（SDS、异硫氰酸胍等）、蛋白酶处理、高盐洗涤,除去其它不需要的核酸分子,沉淀核酸,，去除盐类，有机溶剂等杂质,4,注意事项,避免过酸、过碱及高温,加入DNA酶抑制剂：柠檬酸、氰化物、砷酸盐、EDTA、SDS、苯酚等,蛋白变性剂反应不宜过于剧烈,加入RNA降解酶除RNA,5,学习并掌握用,高,盐法从动物肝脏组织中的提取基因组DNA方法及其原理。,一、实验目的,6,二、实验原理,核酸在真核细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，用DNP和RNP表示。,DNA-Pro（DNP）,(存在于细胞核),RNA-Pro(RNP),存在于核仁及细胞质),溶于高盐溶液（1mol/L）,微溶于低盐溶液（0.14mol/L）,溶于低盐溶液（0.14mol/L）,微溶于高盐溶液（1mol/L）,7,三、仪器和试剂,1、仪器,：,低速离心机、落地式高速冷冻离心机、摇床、稳压电源、电泳槽、凝胶成像系统。,2、试剂,：,0.14mol/L NaCl0.15mol/L EDTA(pH=8.0)；,2.,5mol/L NaCl；25%SDS；氯仿/异戊醇=24:1（V/V）；95%乙醇；1TAE；琼脂糖；上样缓冲液。,8,四、实验步骤,1、DNA的提取,（1）称取5g鸡肝，置于预冷的研钵中，在冰浴中剪碎，加入10mL预冷的0.14mol/L NaCl-0.14mol/L EDTA溶液，研磨成匀浆液。,（2）将匀浆液加入到15mL刻度离心管中，2000r/min离心10min，弃去上清液。,（,3）,将,沉淀,转移至50mL离心管中，,加入10mL预冷的0.14mol/L NaCl-0.14mol/L EDTA溶液，,充分摇匀,后，于,4,2000r/min离心10min，弃去上清液。,9,四、实验步骤,1、DNA的提取,（4）将上述沉淀转移至100mL锥形瓶中，加入10mL预冷的0.14mol/L NaCl-0.14mol/L EDTA溶液，缓慢搅拌，同时加入750uL 25%SDS溶液，用封口膜封口，置于摇床中，,3,0 150r/min震荡30min。,（5）加入,7,mL,2.,5mol/L NaCl，用封口膜封口，置于摇床中，,3,0 150r/min震荡10min。,（6）再加入1,7,mL 氯仿:异戊醇溶液，用封口膜封口，置于摇床中，,30 1,50r/min震荡20min。,10,四、实验步骤,1、DNA的提取,（7）将混合液转移至50mL刻度离心管中，3500r/min离心10min，取上清至一个新的50mL刻度离心管。,（8）加入20mL95%乙醇溶液，上下颠倒混匀后，,出现丝状物，用枪头挑取丝状物，或者,3500r/min离心5min。,（9）弃去上清液（,注意：缓慢倒去上清液,），沉淀物质即为DNA，空气干燥后即可加入适量的TE缓冲液。,11,四、实验步骤,2、DNA电泳检测,（1）,1%琼脂糖凝胶,：称取0.3g琼脂糖，加入30mL 1TAE缓冲液，在微波炉中加热，反复加热、振荡2-3次，使琼脂糖充分融化。待凝胶冷却至60左右，倒入插入梳子的凝胶板中（避免产生气泡），让凝胶自然凝固。,（2）待凝胶凝固后，小心拔出梳子，避免前后左右摇晃，以免破坏胶面及加样孔，小心将凝胶和胶床放入电泳槽中，加样孔靠近阴极的一端。,（3）,上样电泳,：将适量DNA样品溶液和上样缓冲液混匀后，上样，100V电泳检查，根据指示剂迁移的位置，,12,四、实验步骤,2、DNA电泳检测,（3）,上样电泳,：将适量DNA样品溶液和上样缓冲液混匀后，上样，,6,0V稳压电泳检查，根据指示剂迁移的位置，判断是否中止电泳。切断电源后，再取出凝胶。,（4）,照胶、拍照,：将凝胶泡在EB溶液（,注意：EB溶液为剧毒物，需带上一次性手套拿取凝胶,）中10min左右，进入暗室，使用凝胶成像系统照胶并拍照。,13,匀浆（破碎细胞）要充分，需剪成小块。,变性蛋白质层易散，吸取上清液时应仔细，不要将蛋白质及下层的氯仿吸入。,注意事项,14,