DNA的粗提取与鉴定优质课.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,5.1 DNA的粗提取与鉴定,汕头市潮阳实验学校 任培勇,2018.3,一,.,基础知识,（一）提取,DNA,的方法,1.,提取生物大分子的基本思路,选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。,2.,提取,DNA,的基本思路,提取,DNA,，去除其他成分。,利用,DNA,与,RNA,、,蛋白质,和,脂质,等,在物理和化学性质方面的差异。,DNA,的溶解性,DNA,和蛋白质等成分在不同浓度的,NaCl,溶液中溶解度不同,利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使,DNA,充分溶解,而使杂质沉淀；,或者,让其他成分溶解，,DNA,析出,3.DNA,等大分子的理化性质,DNA,不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。将,DNA,与蛋白质进一步分离。,DNA,不溶于酒精溶液,DNA,对酶、高温和洗涤剂的耐受性,蛋白酶,水解,，,对,DNA,没有影响。,高温,大多数,不能忍受60,80,而,在80以上才会变性。,洗涤剂,溶解细胞膜，能去除,和,;,但对,DNA,没有影响。,蛋白质,蛋白质,DNA,脂质 蛋白质,1.,试剂：,。,2.,条件：,。,3.,现象：,。,4.,总反应式：,（二）,DNA的鉴定,二苯胺,沸水浴条件下，,DNA,遇二苯胺被染成,蓝色,沸水浴,（一）实验材料的选取,（二）破碎细胞，获取含,DNA,的滤液,（三）除去滤液中的杂质,(,纯化,),（四）,DNA,的析出与鉴定,二,.,实验设计,（一）实验材料的选取,从下列材料中选取,2,3,种,:,菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜；鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞；,在液体培养基中培养的大肠杆菌,1.,取材原则：,.,.,2.,能选择,哺乳动物成熟的红细胞吗？,；理由是,。,3.,一般能选大肠杆菌吗？,；,。,取材方便,富含,DNA,不能,哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核和细胞器，没有,DNA,分子,不能,大肠杆菌细胞较小且细胞内所含的,DNA,含量少,二,.,实验设计,（二）破碎细胞，获取含,DNA,的滤液,1.,制备鸡血细胞,向鸡血细胞中加入,柠檬酸钠,的作用是,。,将血液,静置,一段时间后：上清液：,。,下层液：,。,2.,破碎细胞，释放,DNA,加入蒸馏水的目的是,。,过滤：,DNA,存在于,（滤液,/,纱布上）；滤液中含有,。,植物细胞不用蒸馏水而用洗涤剂：,防止血液凝固,血浆,血细胞,使细胞吸水涨破,滤液,DNA,和其他物质（核蛋白、,RNA,等）,二,.,实验设计,能溶解细胞膜，利于,DNA,释放,（三）除去滤液中的杂质,讨论：为什么反复地溶解与析出,DNA,，能够去除杂质？,答：用高盐浓度的溶液溶解,DNA,，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使,DNA,析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出,DNA,，就能够除去与,DNA,溶解度不同的多种杂质,二,.,实验设计,讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？,【方案二】,是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的,DNA,与蛋白质分开；,【方案三】,利用的是,DNA,和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与,DNA,分离。,（四）,DNA,的析出与鉴定,与滤液,体积相等,的,冷却,的,酒精溶液,(,体积分数,95,),，,静置,2,3min,，溶液中会出现白色丝状物；用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水,1.DNA,的析出：粗提取,DNA,二,.,实验设计,2.DNA,的鉴定,向两支试管中分别加入,2mol/L NaCl,溶液,5ml,其中一支试管中加入,DNA,丝状物,各加入,二苯胺,试剂,4ml,混匀后，置于,沸水浴,中加热,5min,待冷却后，比较两只试管中溶液的颜色变化,观察现象：,溶解丝状物的溶液变为,蓝色,【方法步骤】,加入物质,目的,1,.,制备鸡血细胞液,柠檬酸钠溶液,2,.,提取鸡血细胞细胞核物质,20 m1,蒸馏水,3,.,溶解细胞核内的DNA,2,mol,L的NaCI溶液40mL,4,.,析出含DNA的粘稠物,蒸馏水,防止血凝固,加速血细胞破裂溶解,DNA,使,2mol/L,的,NaCl,溶液稀释至,0.14mol/L,使得,DNA,最大限度地析出,以提取动物细胞中的,DNA,为例：,5,.,滤取含DNA的黏稠物,7,.,过滤含DNA的NaCl溶液,8,.,提取含有杂质较少的DNA,9,.,DNA的鉴定,6,.,将DNA的黏稠物再溶解,2 molL NaCl溶液20 mL,0.14,molLNaCl溶液40 mL,冷却的,95,的酒精,50 mL,加入物质,观察你提取的,DNA,颜色，如果不是白色丝状物，,说明,DNA,中的杂质较多；,二苯胺鉴定出现蓝色，说明实验基本成功；,如果不呈现蓝色，可能所提取的,DNA,含量低，或实验操作中出现错误，需要重新制备。,四、课题成果评价,是否提取出了,DNA,五、课题延伸,【归纳总结】,DNA,粗提取中,“,重复操作,”,的目的辨析,(1),两次加入蒸馏水。,第一次,加蒸馏水,目的是使血细胞吸水涨破,释放出核内的,DNA;,第二次,加蒸馏水,目的是稀释,NaCl,溶液,使其浓度降至,0.14mol/L,最终使大量,DNA,析出。,(2),三次过滤。,第一次过滤,用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液,是为了得到含,DNA,的滤液,;,第二次过滤,含有黏稠物的,NaCl,溶液,是为了得到从低浓度的,NaCl,溶液中析出的附着在纱布上的含,DNA,的黏稠物,;,第三次过滤,溶解有,DNA,的,NaCl,溶液,目的是为了得到溶解有,DNA,的滤液。,练习,1,、请解释提取,DNA,的实验操作中主要的步骤的目的。,提取,DNA,的第一步是材料的选取，其目的是一定要选取,DNA,含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；,第二步是,DNA,的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的,DNA,全部溶解；,第三步是,DNA,的纯化，即根据,DNA,的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将,DNA,与杂质分开；最后一步是对,DNA,进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。,3.,实验中,NaCl,的物质的量浓度为,2 mol,L,和,014 mol,L,对,DNA,有何影响,?,2.,在,DNA,的粗提取实验过程中，两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是,(),。,A.,稀释血液、冲洗样品,B.,使血细胞破裂、降低,NaCl,浓度使,DNA,析出,C.,使血细胞破裂、增大,DNA,溶解量,D.,使血细胞破裂、提取含杂质较少的,DNA,B,答：前者是溶解,DNA,，后者是使,DNA,析出,4.DNA,遇二苯胺,(,沸水浴,),会染成,(),A.,砖红色,B.,橘黄色,C.,紫色,D.,蓝色,5.,提取鸡血中的,DNA,时，为什么要除去血液,中的上清液,?,答：,DNA,的提取，关键是对杂质的去除，由于上清液是血液中的血浆部分，不含,DNA,，所以要除去上清液,(,含有蛋白质,),。,D,注：,血液加入抗凝剂后分成，上层是血浆，下层是红细胞,。,血液自然凝固后淡黄色液体为血清,。,【复习提问】,1.,将目的基因在体外进行扩增的技术是,。,2.,扩增的原理是,。,3.,前提是要有,，如何合成？,。,4.PCR,反应的基本步骤：,、,、,。,5.,延伸时需要加入,两种,引物，原因是,。,6.,经过,N,次复制，需要两种引物共,个。,PCR,技术,DNA,分子双链复制,根据已知目的基因的核苷酸序列合成,引物,变性,复性,延伸,DNA聚合酶只能从3端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链,同时,被,扩增,2,N,-,2,【思维拓展】,高中涉及,“,DNA,”,的相关知识归纳,(1)DNA,是,的简称,其基本单位为,彻底水解,后得到共,种物质,元素组成,为有且仅有,。,(2)DNA,一般为由,两,条,平行链组成的,双螺旋结构,存在于,所有有细胞结构的生物和,DNA,病毒体内。,(3),染色质,主要,由,组成,可以被碱性燃料,染成深色。,(4),在,“,观察,DNA,和,RNA,在细胞中的分布,”,实验中使用,可以将,DNA,染成,绿色,。,(5),在肺炎双球菌体外转化实验中,艾弗里设计实验证明经,DNA,酶处理后的,DNA,不具有促进,R,型菌转化为,S,型菌的能力。,脱氧核糖核酸,脱氧核糖核苷酸,6,C,、,H,O,、,N,、,P,反向,DNA,与蛋白质,龙胆紫,或,醋酸洋红,或,改良的苯酚品红溶液,甲基绿,方法步骤,加入物质,目的,1,.,制备鸡血细胞液,柠檬酸钠溶液,2,.,提取鸡血细胞细胞核物质,20 m1,蒸馏水,幻灯片,18,3,.,溶解细胞核内的,DNA,2 m1,L,的,NaCI,溶液,40,mL,幻灯片,18,4,.,析出含,DNA,的黏稠物,蒸馏水,5,.,滤取含,DNA,的黏稠物,6,.,将,DNA,的黏稠物再溶解,2 mol,L,的,NaCl,溶液,20 mL,7,.,过滤含,DNA,的,NaC,l,溶液,8,.,提取含有杂质较少的,DNA,冷却的,95,的酒精,50 mL,幻灯片,18,A,:,(1),向试管中加入,0,.,015 mol,L,的,NaCl,溶液,5,mL,(2),加入,DNA,(3)4 mL,二苯胺试剂,9,.,DNA,的鉴定,B,:,(1),向试管中加入,0,.,015mol,L,的,NaCl,溶液,5,mL,(2)4 m,L,二苯胺试剂,加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固,加速血细胞破裂,溶解,DNA,使,2mol/L,的,NaCl,溶液稀释至,0.14mol/L,使得,DNA,最大限度地释出,使含,DNA,的黏稠物被留在纱布上,使含,DNA,的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中,除去含,DNA,的滤液中的杂质,提取,DNA,A,出现蓝色,B,无变化,