RNA的生物合成课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,目录,目录,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,RNA的生物合成,转录,(transcription),是,生物体以,DNA,为模板合成,RNA,的过程。,转录,RNA,DNA,参与转录的物质：,原料,:,NTP(ATP,UTP,GTP,CTP),模板,:,DNA,酶,:,RNA,聚合酶,(RNA polymerase,RNA-pol),其他蛋白质因子,转录的模板,DNA,分子上转录出,RNA,的区段，称为,结构基因,(structural gene),。转录的这种选择性称为,不对称转录,(asymmetric transcription),，它有两方面含义：在,DNA,分子双链上，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录；其二是模板链并非总是在同一单链上。,5,GCAGTACATGTC,3,3,c g t g a t g t a c a g,5,5,GCAGUACAUGUC,3,N,Ala,Val,His,Val,C,编码链,模板链,mRNA,蛋白质,转录,翻译,DNA,双链中按碱基配对规律能指引转录生成,RNA,的一股单链，称为,模板链,(template strand),，也称作,有意义链,或,Watson,链,。相对的另一股单链是,编码链,(coding strand),，也称为,反义链,或,Crick,链,。,5,3,3,5,模板链,编码链,编码链,模板链,结构基因,转录方向,转录方向,不对称转录,RNA,合成由,RNA,聚合酶催化,（一）,RNA,聚合酶能直接启动,RNA,链的合成,DNA,依赖的,RNA,聚合酶催化合成,RNA,；,RNA,合成的化学机制与,DNA,依赖的,DNA,聚合酶催化,DNA,合成相似。,(NMP),n,+NTP (NMP),n+1,+PPi,RNA,延长的,RNA,DNA,聚合酶在启动,DNA,链延长时需要引物存在，而,RNA,聚合酶,不需要引物,就能直接启动,RNA,链的延长。,（二）原核生物,RNA,聚合酶由多个亚基组成,核心酶,(core enzyme),全酶,(holoenzyme),转录起始阶段,转录延长阶段,真核生物具有,3,种不同的,RNA,聚合酶,:,RNA,聚合酶,（,RNA Pol,）,RNA,聚合酶,（,RNA Pol,）,RNA,聚合酶,（,RNA Pol,）,真核生物的,RNA,聚合酶,RNA,聚合酶和,DNA,的特殊序列,启动子,(promoter),结合后，就能启动,RNA,合成。,RNA,聚合酶结合到,DNA,的启动子上起动转录,转录是不连续、分区段进行的。,每一转录区段可视为一个转录单位，称为,操纵子,(operon),。操纵子包括若干个结构基因及其上游,(upstream),的调控序列。,5,3,3,5,结构基因,调控序列,RNA-pol,调控序列中的启动子是,RNA,聚合酶结合模板,DNA,的部位，也是控制转录的关键部位。原核生物以,RNA,聚合酶全酶结合到,DNA,的启动子上而起动转录，其中由,亚基辨认启动子，其他亚基相互配合。,对启动子的研究，常采用一种巧妙的方法即,RNA,聚合酶保护法,。,RNA,聚合酶保护法,开始转录,T T G A C A,A A C T G T,-35,区,(Pribnow box),T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10,区,1,-30,-50,10,-10,-40,-205,3,3,5,RNA-pol,辨认位点,(recognition site),5,5,RNA,聚合酶保护区,结构基因,3,3,用,RNA,聚合酶保护法研究转录起始区,RNA,聚合酶全酶在转录起始区的结合,:,一个典型的真核生物基因上游序列,:,5,3,调控序列,TATA,盒,Inr,YYAN YY,T,A,-30,+1,TATAAA,原核生物的转录过程,The Process of Transcription in Prokaryote,RNA,聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。,DNA,双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。,一、转录起始需要,RNA,聚合酶全酶,转录起始需解决两个问题：,2.DNA,双链局部解开，形成,开放转录复合体,(open transcription complex),；,1.RNA,聚合酶全酶,(,2),与模板结合，形成,闭合转录复合体,(closed transcription complex),；,3.,在,RNA,聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物：,RNApol(,2,)-DNA-pppGpN-OH 3,转录起始复合物,:,5,-pppG-OH +,NTP,5,-pppGp,N,-OH 3,+ppi,转录起始过程：,第一个磷酸二酯键生成后，,亚基即从转录起始复合物上脱落，核心酶连同四磷酸二核苷酸，继续结合于,DNA,模板上，酶沿,DNA,链前移，进入延长阶段。,二、原核生物的转录延长时蛋白质的翻译也同时进行,1.,亚基脱落，,RNApol,聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着,DNA,模板前移；,2.,在,核心酶,作用下，,NTP,不断聚合，,RNA,链不断延长。,(NMP),n,+,NTP,(NMP),n+1,+,PPi,转录空泡,(transcription bubble),：,RNA-pol,（核心酶）,DNA,RNA,转录延长：,5,3,DNA,原核生物转录过程中的羽毛状现象,核糖体,RNA,RNA,聚合酶,在同一,DNA,模板上，有多个转录同时在进行；,转录尚未完成，翻译已在进行。,这种形状说明：,依赖,Rho,因子的转录终止,非依赖,Rho,因子的转录终止,三、原核生物转录终止分为依赖,(Rho),因子与非依赖,因子两大类,转录终止,指,RNA,聚合酶在,DNA,模板上停顿下来不再前进，转录产物,RNA,链从转录复合物上脱落下来。,依据是否需要蛋白质因子的参与，原核生物转录终止分为：,因子是由相同亚基组成的六聚体蛋白质，亚基分子量,46kD,。,因子能结合,RNA,，又以对,poly C,的结合力最强。,因子还有,ATP,酶活性和解螺旋酶,(helicase),的活性。,（一）依赖,因子的转录终止,因子：,因子的作用原理：,目前认为，,因子终止转录的作用是：与,RNA,转录产物结合，结合后,因子和,RNA,聚合酶都可发生构象变化，从而使,RNA,聚合酶停顿，解螺旋酶的活性使,DNA/RNA,杂化双链拆离，利于产物从转录复合物中释放。,（二）非依赖,Rho,因子的转录终止,DNA,模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出,RNA,后，,RNA,产物形成特殊的结构来终止转录。,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU,.3,5UUG,CAGCCUGA,CAAA,UCAGGCUG,AUGGCUGGUGACUUUUU,AGUC,ACCA,GCCU,UUUU,.3,RNA,5,TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT,.3,DNA,UUUU,.,UUUU,.,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAU,GGCUGGUGACU,UUUU,AGUCACCAGCC,UUUUU,.3,近终止区的转录产物形成发夹,(hairpin),结构是非依赖,因子终止的普遍现象。,茎环结构使转录终止的机理：,使,RNA,聚合酶变构，转录停顿；,使转录复合物趋于解离，,RNA,产物释放。,5pppG,5,3,3,5,RNA-pol,真核生物的转录过程,The Process of Transcription in Eukaryote真核生物的转录过程比原核复杂。二者的转录起始过程有较大区别，转录终止也不相同。,一、真核生物有三种,DNA,依赖性,RNA,聚合酶,真核生物具有,3,种不同的,RNA,聚合酶,:,RNA,聚合酶,（,RNA Pol,）,RNA,聚合酶,（,RNA Pol,）,RNA,聚合酶,（,RNA Pol,）,真核生物的,RNA,聚合酶,真核生物,RNA,聚合酶的结构比原核生物复杂，所有真核生物的,RNA,聚合酶都有两个不同的大亚基和十几个小亚基,.,RNA,聚合酶,由,12,个亚基组成，其最大的亚基称为,RBP1,。,RNA,聚合酶,最大亚基的羧基末端有一段共有序列,(consensus sequence),为,Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser,的重复序列片段，称为,羧基末端结构域,(carboxyl-terminal domain,CTD),。,CTD,对于维持细胞的活性是必需的。,二、转录起始需要启动子、,RNA,聚合酶和转录因子的参与,（一）转录起始前的上游区段具有启动子核心序列,不同物种、不同细胞或不同的基因，转录起始点上游可以有不同的,DNA,序列，但这些序列都可统称为,顺式作用元件,(cis-acting element),。,一个典型的真核生物基因上游序列,:,5,3,调控序列,TATA,盒,Inr,YYAN YY,T,A,-30,+1,TATAAA,顺式作用元件包括启动子、启动子上游元件,(upstream promoter elements),或,promoter-proximal elements),等近端调控元件和增强子,(enhancer),等远隔序列。,起始点上游多数有共同的,TATA,序列，称为,Hognest,盒或,TATA,盒,(TATA box),。通常认为这就是,启动子的核心序列,。,转录起始点,TATA,盒,CAAT,盒,GC,盒,增强子,顺式作用元件,(cis-acting element),AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,OCT-1,OCT-1,：,ATTTGCAT,八聚体,二）转录起始前复合物,真核生物,RNA-pol,不与,DNA,分子直接结合，而需依靠众多的转录因子，形成,转录起始复合物,(pre-initiation complex,PIC),。,POL-,TFF,A,B,由,RNA-Pol,催化转录的,PIC,POL-,TFF,H,E,TBP,TAF,TFD-A-B-DNA,复合物,TATA,A,B,TBP,TAF,TATA,H,E,CTD-,P,PIC,组装完成，,TFH,使,CTD,磷酸化,能直接、间接辨认和结合转录上游区段,DNA,的蛋白质，现已发现数百种，统称为,反式作用因子,(trans-acting factors),。,反式作用因子中，直接或间接结合,RNA,聚合酶的，则称为,转录因子,(transcriptional factors,TF),。,（三）少数几个反式作用因子的搭配启动特定基因的转录,为了保证转录的准确性，不同基因需不同转录因子。,拼板理论,(piecing theory),：,少数几个反式作用因子（主要是可诱导因子和上游因子）之间互相作用，再与基本转录因子、,RNA,聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。可诱导因子和上游因子常常通过辅激活因子或中介子与基本转录因子、,RNA,聚合酶结合，但有时也可直接与基本转录因子、,RNA,聚合酶结合。,三、真核生物转录延长过程中没有转录与翻译同步的现象,真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。,RNA-pol,前移处处都遇上核小体。,转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。,RNA-Pol,RNA-Pol,RNA-Pol,核小体,转录延长中的核小体移位,转录方向,四、真核生物的转录终止和加尾修饰同时进行,真核生物的转录终止，是和转录后修饰密切相关的。,真核生物,mRNA,有聚腺苷酸,(poly A),尾巴结构，是转录后才加进去的。,转录不是在,poly A,的位置上终止，而是超出数百个乃至上千个核苷酸后才停顿。已发现，在读码框架的下游，常有一组共同序列,AATAAA,，再下游还有相当多的,GT,序列。这些序列称为,转录终止的修饰点,。,5,-AAUAAA-,5,-AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAA GTGTGTG,转录终止的修饰点,5,5,3,3,3,加尾,AAAAAAA 3,mRNA,转录终止,和转录后修饰密切相关。,真核生物的转录终止及加尾修饰,复制和转录的区别,真核生物,RNA,的加工,Post-transcriptional Modification of Eukaryotic RNA,真核生物转录生成的,RNA,分子是初级,RNA,转录物,(primary RNA transcript),，几乎所有的初级,RNA,转录物都要经过加工，才能成为具有功能的成熟的,RNA,。,加工主要在细胞核中进行。,几种主要的修饰方式：,1.,剪接,(splicing),2.,剪切,(cleavage),3.,修饰,(modification),4.,添加,(addition),一、真核生物,mRNA,的加工包括首、尾修饰和剪接,（一）前体,mRNA,在,5-,末端加入“帽”结构,大多数真核,mRNA,的,5-,末端有,7-,甲基鸟嘌呤的帽结构。,这个真核,mRNA,加工过程的起始步骤由两种酶，,加帽酶,(capping enzyme),和,甲基转移酶,(methyltransferase),催化完成。,帽子结构：,5 pppGp,5 GpppGp,pppG,ppi,鸟苷酸转移酶,5,m,7,GpppGp,甲基转移酶,SAM,帽子结构的生成过程：,5 ppGp,磷酸酶,Pi,帽子结构的意义：,可以使,mRNA,免遭核酸酶的攻击；,也能与帽结合蛋白质复合体,(cap-binding complex of protein),结合，并参与,mRNA,和核糖体的结合，启动蛋白质的生物合成。,地球上,两种,基本的,细,胞形式,DNA,原核,细,胞,真核,细,胞,proteins,cap,5,3,tail,mature,mRNA,DNA,5,3,process,mRNA,ribosome,mRNA,proteins,（二）前体,mRNA,在,3,端特异位点断裂并加上多聚腺苷酸尾,尾部修饰是和转录终止同时进行的过程。,poly A,的有无与长短，是维持,mRNA,作为翻译模板的活性，以及增加,mRNA,本身稳定性的因素。,一般真核生物在胞浆内出现的,mRNA,，其,poly A,长度为,100,至,200,个核苷酸之间，也有少数例外。,前体,mRNA,分子的断裂和加多聚腺苷酸尾是多步骤过程。,5,-AAUAAA-,5,-AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAA GTGTGTG,转录终止的修饰点,5,5,3,3,3,加尾,AAAAAAA 3,mRNA,转录终止,和转录后修饰密切相关。,维持,mRNA,作为翻译模板的活性,增加,mRNA,稳定性,poly A,结构的意义：,外显子,(exon),和内含子,(intron),外显子：,在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟,RNA,的核酸序列。,内含子：,隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。,真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。,断裂基因,(splite gene),C,A,B,D,编码区,A,、,B,、,C,、,D,非编码区,鸡卵清蛋白基因,hnRNA,首、尾修饰,hnRNA,剪接,成熟的,mRNA,鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰,鸡卵清蛋白成熟,mRNA,与,DNA,杂交电镜图,DNA,mRNA,（三）,mRNA,的剪接,除去,hnRNA,中的内含子，将外显子连接。,核内的初级,mRNA,称为,杂化核,RNA(hetero-nuclear RNA,hnRNA),snRNA(small nuclear RNA),核内的蛋白质,小分子核糖核酸蛋白体,snRNA,snRNP,与,hnRNA,结合成为并接体,snRNP,与,hnRNA,结合成为并接体,具有酶促活性的,RNA,称为核酶。,核酶,(ribozyme),核酶研究的意义,核酶的发现，对中心法则作了重要补充；,核酶的发现是对传统酶学的挑战；,利用核酶的结构设计合成人工核酶。,1989,年诺贝尔化学奖,授予了分别独立地发现具有酶活性的,RNA,分子的美国科罗拉多大学（,ColoradoUniversity,）的,Thomas R.Cech,（,42,岁）和,耶鲁大学（,YaleUniversity,）的,Sidney Altman,（,50,岁）。,Thomas R.Cech Sidney Altman,在研究核糖核酸,(RNA),的催化功能时，他们发现,RNA,也可以有生物催化功能。,RNA,分子中，不同部位分别扮演催化活性。这一发现，改变了以往认为，使得生物体内各种生化反应得以在室温的环境下完成，都是借助于多种酶分子的催化作用，具有催化活性的酶分子都无例外地是蛋白质的传统概念。开创了核酸化学中的一个新领域。,mRNA,的剪切（,cleavage,）和剪接（,splicing,）,剪接（,splicing,）,：,去除初始转录产物上的内含子，将外显子连接为成熟的,RNA,。,剪切（,cleavage,）,：,去除某些内含子，在上游的外显子,3-,末端加上,poly A,。,选择性剪接（,alternative splicing,）,剪切 剪接,选择性剪接,降钙素基因相关肽,许多真核生物基因转录后有一个对,mRNA,外显子加工的过程，可通过特定碱基的插入、缺失或置换，使,mRNA,序列中出现移码突变、错义突变或无义突变，导致,mRNA,与其DNA,模板序列不匹配，使同一前体,mRNA,翻译出序列、功能不同的蛋白质。这种基因表达的调节方式称为,mRNA,编辑（,mRNA editing,）。,RNA,编辑作用说明，基因的编码序列经过转录后加工，是可有多用途分化的，因此也称为分化加工,(differential RNA processing),。,mRNA,的编辑,(mRNA editing),人类,apo B,基因,mRNA,（,14500,个核苷酸）,肝脏,apo B100,（分子量为,500 000,）,肠道细胞,apo B48,（分子量为,240 000,）,mRNA,编辑,二、,tRNA,的转录后加工,tRNA,前体,RNA pol,TGGCNNAGTGC,GGTTCGANNCC,DNA,RNAaseP,、内切酶,tRNA,核苷酸转移酶、连接酶,ATP,ADP,碱基修饰,（,2,）还原反应,如：,U,DHU,（,3,）核苷内的转位反应,如：,U,（,4,）脱氨反应,如：,A,I,如：,A,A,m,（,1,）甲基化,（,1,）,（,1,）,（,3,）,（,2,）,（,4,）,三、,rRNA,的转录后加工,转录,45S-rRNA,剪接,18S-rRNA,5.8S,和,28S-rRNA,rDNA,内含子,内含子,28S,5.8S,18S,真核生物的,RNA,聚合酶,