医学课件酶类药物的分析.ppt

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Ethylester,，,ATEE,）作底物，通过分光光度法测定此,酶对底物的水解速率,来检查该酶的含量限度。,18,第三节 酶活力测定方法,固定时间法,连续监测法,固定浓度法,19,一、固定时间法,（终点法）,在适宜的条件下，使酶和底物共同保温,一定时间,，测定,产物生成的量,或,底物消耗的量，,计算出酶的含量（或活力）。,E,表示酶浓度，,P,为反应产物浓度，,t,表示酶作用时间，,K,为常数。,20,实例：,（,1,）,胰,弹性蛋白酶,活力单位定义：在,pH 8.8,，,37,条件下作用,20min,，水解,1.0mg,刚果红弹性蛋白的酶量定义为一个活力单位。,（,2,）,天冬氨酸酶,活力,单位定义：在测定条件下，每小时每克细胞转化生成,1,mol,天冬氨酸所需的酶量,。,21,注意事项,缺点：无法了解整个反应过程是否都是零级反应。,注意事项：,1,、底物饱和,2,、时间,22,二、连续监测法（反应速度法）,在酶反应过程中，,连续记录不同时间的底物消耗量或产物生成量,。,酶底物大多是人工合成的“色素元”，其本身无色，经,酶作用后释放出有色的反应产物,。根据反应过程中吸收度增高速率，算出酶活力单位。,测定时间,.,例如：,磷酸对硝基苯酚酯 对硝基苯酚,法,下文为中国药典201,5,版胰蛋白酶活力测定方法，请仔细阅读，并阐述此酶活力测定的原理？其酶活力测定方法属于哪一种？,胰蛋白酶作用位点有哪些？写出测定所用底物的英文缩写？,供试品的制备：精密称取本品适量，用盐酸（,0.001mol/L,）制成每,1ml,中含,50,60,胰蛋白酶单位的溶液。,底物溶液的制备：取,N-,苯甲酰,-L-,精氨酸乙酯盐酸盐,85.7mg,，加水溶解使成,100ml,，作为底物原液；底物溶液应在制成后,2,小时内使用。,测定法：取底物溶液,3.0ml,，加盐酸溶液（,0.001ml/L,）,0.2ml,，混匀，作为空白，取供试品溶液,0.2ml,加底物溶液（预热至,250.5,）,3.0ml,，立即计时并摇匀，使比色池内温度保持在,250.5,，照紫外可见分光光度法在,253nm,的波长处，每隔,30,秒种读取吸收度，共,5,分钟。每,30,秒钟吸收度的变化率应恒定在,0.015,0.018,之间，呈线性关系的时间不得少于,3,分钟。若不符合上述要求，应调整供试品的溶液浓度，另行测定。以吸收度为纵坐标，时间为横坐标做图，取在,3,分钟内成直线部分的吸收度，按下式计算。,式中,P,为每,1mg,供试样品中胰蛋白酶的单位数；,A,1,为直线上终止的吸收度；,A,2,为直线上开始的吸收度；,T,为,A,1,至,A,2,读数的时间（分）；,W,为测定液中供试品的量；,0.003,为上述条件下，吸收度每分钟改变,0.003,相当于一个胰蛋白酶单位。,24,三、固定浓度法,（,fixed-concentration essay,）,根据酶催化反应，使,反应产物,达到额定的浓度时其,反应时间与酶浓度成反比,的原理进行设计的。,P=KEt,以所需时间的倒数（,1/t,）对酶浓度作图即可制备标准曲线。,优点：,1,、记录时间。,2,、准确,25,第四节 酶活性测定方法的设计,一、影响因素,二、底物与产物的测定方法,三、测定条件的选择,26,一、影响因素,1,、,底物,2,、,pH,3,、,温度,4,、,酶浓度,5,、,空白和对照,27,底物,酶可以同时作用多个底物。,以,Km,最小者,作为此酶的生理底物。,从,底物性质,看，选用的底物最好在物理化学性质上与产物不同，利于测定。,从底物浓度看，为不使酶反应受到它的控制，反应系统应使用足够高的,底物浓度,。,28,胰凝乳蛋白酶几种底物的,Km,底物,Km,（,mmol/L,）,N,苯甲酰,酪氨酰胺,2.5,N,甲酰,酪氨酰胺,12.0,N,乙酰,酪氨酰胺,32.0,甘氨酰,酪氨酰胺,122.0,29,底物浓度对酶反应速度的影响,S/K,m,V/V,max,0.01,0.99,0.1,1.0,1,50,10,91,100,99,30,pH,酶活力测定选用,缓冲体系,。,不同缓冲液所受影响不同。,磷酸盐,所受影响较小，而,Tris,则受影响较大。,酶溶液用量与底物溶液比例不超过,10,为宜。,31,温度,温度变化,1,，反应速度可能相差,10,以上,，控制在,0.1,。,反应温度一般为,25,，此时酶不易灭活，,Km,较小，可以使用较低的底物浓度。,有些酶在,37,不稳定。,32,酶浓度,酶样要充分稀释,。,取,3,个不同酶量测得的,产物量,和,酶浓度,之间为正比关系，这样的酶浓度范围就是适当的。,33,空白和对照,空白：指杂质反应或自发反应引起的变化量，代表未知因素的影响。,分为,完全空白,（如测定时要终止反应，则空白可先加终止反应试剂再加酶）。,酶空白,底物空白,34,二、底物与产物的测定方法,（酶反应的检测方法）,1,、,化学方法,：用化学法测定其中某一底物或产物的变化值。,2,、,分光光度法,：,常用的有,比色法,和,紫外分光光度法,。,3,、,荧光测定法：,简单、灵敏、快速。,4,、,电化学分析法,（,1,）,离子选择性电极分析法,（,2,）,微电流法,5,、,其他方法,如测定气体的测压法，测定产物旋光度变化值的旋光测定法。,酶活力测定反应的检测方法,按照酶法分析方法测定酶活性时，需要跟踪酶促反应中某一反应底物或产物的浓度随时间发生的变化量（速度法），或测量酶促反应中反应产物或底物浓度的总变化量（终点法）。可针对某些易于测定的酶促反应底物或产物选择具体的检测方法，包括容量分析法、气体检测法、光学检测法、黏度测定法、酶联免疫法等分光光度法 若酶促反应中，反应底物或产物之一由于化学结构的改变，其吸光度的强度发生变化，可以通过测定该酶促反应系统的光吸收度的变化量，推算出酶的活力。多数酶类药物的含量检测（效价测定）均采用分光光度法，如胃蛋白酶、糜蛋白酶、门冬酰胺酶、溶菌酶等。,36,三、测定条件的选择,1,、,单因素选择,2,、正交设计,多因素选择,37,1,、,单因素选择比色法测溶菌酶活性,以染料艳红,K-2BP,标记的,M,Lysodeikticus,为,底物,，分解后产生游离染色碎片（产物）,离心除去未分解底物，上清液比色,吸收度为溶菌酶活力的函数,。,38,测定条件选择,S pH,（,1,）酶反应,底物浓度,曲线,以染料标记的,M,Lysodeikticus,为底物，酶量为,20g,时，,1%,底物浓度已接近使酶饱和。,（,2,）酶反应,PH,曲线,磷酸缓冲液和柠檬酸,磷酸缓冲液。,不同组分的缓冲液，其最适,PH,稍有不同，选用,pH6.5,磷酸缓冲液。,39,测定条件选择离子强度、反应时间及,E,（,3,）,离子强度,对酶反应的影响,离子强度在,0.3mol/L,以上为宜，选用,0.5mol/L,。,（,4,）酶反应过程曲线,(,反应时间,),和,酶浓度,曲线,酶量为,20,g,时，反应在,30,分钟以内，吸收度与反应时间有良好的线性关系，测定系统选用,15,分钟,。,酶量在,50,g,之内,，吸收度与酶浓度具有线性关系。,40,测定条件,1%,染色菌体,缓冲液,1ml,37,水浴保温约,5,分钟,加,酶试样,0.5ml,准确反应,15,分钟,加入酸,/,乳化剂混合液,2ml,，终止反应，反应液经离心，上清液于,540nm,比色，所得吸收度从酶浓度标准曲线即可查出试样中溶菌酶含量。,41,二、正交设计多因素选择,正交试验设计（,Orthogonal experimental design,）是一种高效的,利用正交表来安排多因素多水平设计试验,的方法。,通过巧妙的安排和分组，,用较少的试验次数，,就能,分析各因素的作用大小,，找出最佳的试验条件。,利用各因素所对应指标的,极差,R,及平均极差,D,作出判断。,42,正交试验优选中性蛋白酶活力测定条件,中性蛋白酶是一种,蛋白水解酶,，活力测定以,酪蛋白为底物,，水解产物与福林试剂在碱性情况下反应生成有色物质，于,680nm,处测定吸收值,。,中性蛋白酶作用受,缓冲液的,pH,值、底物浓度、反应时间,及,酶浓度,等因素的影响。,供试品：,0.01%,的中性蛋白酶溶液。,底物：酪蛋白,43,实验方案,实验取四个因素：,PH,值、底物浓度、反应时间、酶浓度,。,每个因素选三水平，属于多因素多水平，为此选用,L,9,（,3,4,）,正交表进行实验。,44,45,正交试验表,实验号,A,缓冲液,pH,值,B,底物浓度,(%),C,反应时间min),D,酶浓度（,U/ml,）,1,1,1,1,1,2,1,2,2,2,3,1,3,3,3,4,2,1,2,3,5,2,2,3,1,6,2,3,1,2,7,3,1,3,2,8,3,2,1,3,9,3,3,2,1,46,正交实验安排表,47,正交实验安排表,48,各因素试验值计算结果,平均极差越大，对应的因素影响越大。,缓冲液,PH,值,7.2,，底物浓度,0.5%,，酶浓度用,100U/ml,为最佳反应条件。,反应时间为,10,，,20,，,30min,，对,OD,值无显著影响。,49,各因素试验值的方差分析,结论：,PH值（A）,、,底物浓度（B）,、,酶浓度（D）,为非常显著因子反应时间（C）为非显著因子。,50,第五节,酶类药物的检测,肽键水解酶,脂键水解酶,糖苷键水解酶,其它（超氧化物歧化酶）,51,一、肽键水解酶,1,、胰蛋白酶,2,、弹性蛋白酶,3,、尿激酶,52,53,1,、胰蛋白酶,（,Trypsin,）,胰蛋白酶（,Trypsin,）：由,动物胰脏中提取的一种蛋白水解酶,。,牛胰蛋白酶：,223,个氨基酸，分子量,24000,，,等电点,10.1,。,猪胰蛋白酶：,214,个氨基酸，分子量,23400,，,等电点,10.8,。,胰蛋白酶最适,pH,为,7.68.0,，电泳纯的胰蛋白酶的比活为,8000,单位,/mg,。,胰蛋白酶,54,55,胰蛋白酶56,原理,胰蛋白酶专一作用于赖氨酸、精氨酸等,碱性氨基酸,的羧基组成的,肽键、酰胺键及酯键,，水解速度为,酯键,酰胺键,肽键。,BAEE(Benzoyl-L-Arginine-Ethyl-Ester),BAA(Benzoyl-L-Arginine-Anide),苯甲酰,L,精氨酸乙酯（,BAEE,）在胰蛋白酶的作用下，酯键被水解生成苯甲酰,L,精氨酸，在,253nm,波长处的吸收度随酶促反应递增，因此连续记录不同时间的产物生产量，根据活力单位定义计算酶活力。,57,测定法：,取呈,直线的吸收度,，按下式计算：,P,为,每,mg,供试品含胰蛋白酶的单位,，,U,；,A,1,为直线上终止的吸收度；,A,2,为直线上开始的吸收度；,T,为,A,1,至,A,2,读数的时间，,min,；,W,为测定液中供试品的量，,mg,；,吸收度每分钟改变,0.003,，即相当于,1,个胰蛋白酶单位,。,下文为中国药典201,5,版胰蛋白酶活力测定方法，请仔细阅读，并阐述此酶活力测定的原理？其酶活力测定方法属于哪一种？胰蛋白酶作用位点有哪些？写出测定所用底物的英文缩写？,供试品的制备：精密称取本品适量，用盐酸（,0.001mol/L,）制成每,1ml,中含,50,60,胰蛋白酶单位的溶液。,底物溶液的制备：取,N-,苯甲酰,-L-,精氨酸乙酯盐酸盐,85.7mg,，加水溶解使成,100ml,，作为底物原液；底物溶液应在制成后,2,小时内使用。,测定法：取底物溶液,3.0ml,，加盐酸溶液（,0.001ml/L,）,0.2ml,，混匀，作为空白，取供试品溶液,0.2ml,加底物溶液（预热至,250.5,）,3.0ml,，立即计时并摇匀，使比色池内温度保持在,250.5,，照紫外可见分光光度法在,253nm,的波长处，每隔,30,秒种读取吸收度，共,5,分钟。每,30,秒钟吸收度的变化率应恒定在,0.015,0.018,之间，呈线性关系的时间不得少于,3,分钟。若不符合上述要求，应调整供试品的溶液浓度，另行测定。以吸收度为纵坐标，时间为横坐标做图，取在,3,分钟内成直线部分的吸收度，按下式计算式中,P,为每,1mg,供试样品中胰蛋白酶的单位数；,A,1,为直线上终止的吸收度；,A,2,为直线上开始的吸收度；,T,为,A,1,至,A,2,读数的时间（分）；,W,为测定液中供试品的量；,0.003,为上述条件下，吸收度每分钟改变,0.003,相当于一个胰蛋白酶单位。,59,2,、,胰,弹性蛋白酶（,Elastase,）,肽键水解酶,，存在于哺乳动物胰脏。,胰弹性蛋白酶是由,240,个氨基酸组成的单一肽链，有四对二硫键。分子量为,25900,，等电点为,9.5,。,胰弹性蛋白酶除水解弹性蛋白外，还可以水解血红蛋白、酪蛋白等蛋白。,刚果红弹性蛋白,。,60,胰,弹性蛋白酶测定,原理,刚果红弹性蛋白法,：以刚果红,弹性蛋白为底物，由于刚果红,弹性蛋白结合的共价键能被弹性酶水解，根据,刚果红在,495nm,处有最大吸收，由标准曲线即可查得弹性酶单位数。,单位：,20,分钟水解,1mg,刚果红弹性蛋白,所需的酶量为,一个弹性酶活力单位,。,61,方法,:,62,3,、尿激酶,（,Urokinase,）,由人尿制得的一种碱性蛋白水解酶。,主要作用是激活人体内,纤维蛋白溶酶原,使其成为有活性的,纤维蛋白溶酶,，从而解聚血纤维蛋白，溶解血栓。,天然尿激酶的分子量为,54000,，,其作用于纤维蛋白溶解酶原的赖氨酸或精氨酸键使其裂解成纤维蛋白溶解酶,。,63,效价测定原理,(,气泡上升法),尿激酶,激活人体内,纤维蛋白溶酶原,使其转化成,纤维蛋白溶酶,；,纤维蛋白原,在,凝血酶,的作用下，转变成,纤维蛋白凝块,，此凝块在,纤维蛋白溶酶,作用下，水解为可溶性小分子多肽。,在,纤维蛋白溶酶原,过量的情况下，,尿激酶量,与,纤维蛋白凝块的溶解时间,的对数成直线关系。,64,操作,(,气泡上升法,),试管中加,纤维蛋白原,溶液,0.3ml,（,37,水浴）,标准品,(,或供试品,)1.0ml,加混合溶液,0.4ml,立即摇匀计时，,反应系统应在,30,45,秒内凝结,，当,凝块内小气泡上升到系统体积一半时,作为反应终点。,以尿激酶的浓度为横坐标，以反应时间的对数为纵坐标。,65,二脂键水解酶,胰脂肪酶,(Pancreatic Lipase),胰脂肪酶是一种水解酶，在一定条件下把,甘油三脂类脂肪,水解，最后生成,甘油及脂肪酸,。,底物,:,橄榄油,用已知浓度的,标准碱溶液,滴定，可定量地测定,脂肪酸,的量，从而得知,脂肪酶,活力。,66,测定,67,计算,每分钟,水解橄榄油,产生,1mol,脂肪酸,的酶量，为,1,个活力单位。,每克含有的胰脂肪酶单位,A:,供试品消耗,NaOH,（,0.1mol/L,）的体积,B:,空白消耗,NaOH,（,0.1mol/L,）的体积,W:,供试品取样量（,g,）,N:,供试品稀释倍数。,68,三、糖苷键水解酶,溶菌酶,蛋清中提取的能,分解粘多糖的碱性水解酶,。,溶菌酶,（,Lysozyme,）,具有抗菌、抗病毒等作用。,溶菌酶分子量为,14000,15000,，由,129,个氨基酸残基组成，等电点为,10.011.1,。,溶菌酶属糖苷,键,水解酶，能以某些细菌细胞中的多糖为底物。,69,溶菌酶作用位点,70,青霉素,转肽酶底物末端的二肽D-Ala-D-Ala结构,71,效价测定比浊法,以,溶酶小球菌,为底物，主要成分为,粘多糖,，粘多糖由,NAG,和,NAM,重复而成。,只能水解,NAM C1,和,NAG C4,之间的,1,，,4,糖苷键,。,溶酶小球菌胞壁中的粘多糖经过溶菌酶的水解后，导致,溶菌,，溶液的,吸收度下降,。,在一定的条件下，每分钟,吸收度下降,0.001,为一个酶活力单位。,72,比浊法测定,计算：,酶活力单位（,u/mg,）,=,W,为测试液中供试品的重量（,g,）,73,比色法,-,测定溶菌酶活性,用染料艳红,K,2BP,标记的,M.Lysodeikticus,为底物，酶催化细胞壁分解时游离出染色碎片（产物）,反应后离心除去未分解底物，上清液比色，,吸收度为溶菌酶活力的函数,。,74,溶菌酶效价测定比色法,75,四、超氧化物歧化酶,（,Superoxide dismutase,）,由,动物红细胞,制得的金属酶，能催化超氧阴离子转化成过氧化氢和氧。,来源于牛、猪、人红血球的超氧化物歧化酶（,SOD,）含铜和锌，分子量,32000,左右。,SOD,对热较稳定,，在,pH5.39.5,范围内对酶活性影响不大。,牛红细胞,SOD PI,为,4.95,。,76,效价测定,SOD,测定方法：,间接法：使用,氧自由基指示清除剂,，,SOD,与指示清除剂竞争,O,2,-,，从而抑制指示清除剂与,O,2,-,的结合，根据,指示清除剂与,O,2,-,反应速度的变化,可间接测定,SOD,的活性。,间接法包括：,黄嘌呤氧化酶细胞色素,C,法,和,邻苯三酚法,。,77,黄嘌呤氧化酶细胞色素,C,法,原理：,在有氧条件下，黄嘌呤氧化酶能催化黄嘌呤成尿酸，与此同时产生,O,2,-,，氧化型细胞色素,C,被,O,2,-,还原为还原型细胞色素,C,，后者在,550nm,有最大吸收，因此测定氧化性细胞色素,C,在加入,SOD,前后的光吸收变化可间接计算酶活性。,78,方法,79,注意点,在特定条件下，,25,（,pH7.8,）每分钟抑制细胞色素,C,还原速率达,50,所需要的酶量为一个活力单位。,注意事项：,重金属离子易使黄嘌呤氧化酶失活，因此反应体系中必须添加,EDTA,。,反应体系中含过氧化氢酶可引起还原型细胞色素,C,发生过氧化作用，从而干扰检测的正确。,80,邻苯三酚法,原理：,在碱性条件下，邻苯三酚会发生自氧化生成红 酚，同时生成,O,2,-,，当有,SOD,存在时由于它能催化,O,2,-,与,H,+,结合生成,O,2,和,H,2,O,2,，从而阻止了中间产物的积累。,定义,:,在一定条件下，,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达,50,的酶量,为一个酶活力单位。,81,操作,定义,:,在一定条件下，,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达,50,的酶量,为一个酶活力单位。,82,门冬酰胺酶（,L,-Asparaginase,）,本品系自大肠杆菌（,Ecoli ASI.357,）中提取制备的具有,酰氨基水解作用的酶。,每毫克蛋白含门冬酰胺酶效价不得低于,250U,。,抗肿瘤酶类药物,(,肿瘤细胞缺乏,L-,门冬酰胺合成酶,),。,治疗小儿急性淋巴细胞性白血病和淋巴肉瘤。,83,测定,在上述规定条件下，每分钟催化,L-,门冬酰胺水解,释放,1g,分子氨所需的酶量,定义为,1,个酶活力单位,比活力测定方法：采用,Lowry,法测定蛋白质含量，比活力,=,酶活力,(U)/,蛋白含量,(mg),。,84,天冬氨酸酶活力的测定,，,一个酶活力单位定义为在测定条件下，,每小时每克,细胞转化生成,1,mol,天冬氨酸所需的酶量.,85,实例：尿激酶（,urokinase,）,本品系从,新鲜人尿中提取,的一种,激活纤维蛋白溶酶原,的酶。,由高分子量,54000,和低分子量,33000,组成的混合物，,高分子量含量不得少于,90%,，每,1mg,蛋白中尿激酶活力不得少于,12,万,U,，蛋白分解药物。,86,尿激酶,（一）性状,本品为白色非结晶状粉末,（二）鉴别,取比活力测定项下的,供试品,溶液，用巴比妥,-,氯化钠缓冲液（,pH7.8,）稀释成每,1ml,中含,20U,的溶液，吸取,1ml,，加,纤维蛋白原,溶液,0.3ml,，再依次加入,纤维蛋白溶酶原,溶液,0.2ml,，,凝血酶,溶液,0.2ml,，迅速摇匀，立即置,37,0.5,恒温水浴中保温，记时，反应系统,应在,30,45s,内凝结，且凝块在,15min,内重新溶解,。以,0.9%,氯化钠溶液作空白，同法操作，凝块在,2,h,内不溶。,87,（三）检查,1,溶液的澄清度与颜色，,应澄清无色。,2,分子组分比,取本品，加水制成每,1ml,中含,2mg,的溶液后，加入等体积的缓冲液，置水浴中,3min,，放冷，作为供试品溶液；取供试品溶液,10l,，加至样品孔，照电泳法测定，按下式计算高分子尿激酶相对含量（,%,）。,88,（三）检查,3,干燥失重,取本品，以五氧化二磷为干燥剂，在,60,减压干燥至恒重，减失重量不得过,5.0%,。,4,异常毒性取本品，加氯化钠注射液制成每,1ml,中含,5000U,的溶液，依法检查，按静脉注射法给药，应符合规定。,5,热原,取本品，加氯化钠注射液制成每,1ml,中含,20000U,的溶液，依法检测，按家兔体重每,1kg,注射,1ml,，应符合规定。,89,6.,凝血质样活性物质,（,1血浆的制备,。,（,2,）复钙试验,取小试管，加,血浆,0.1ml,、,6-,氨基己酸溶液,0.1ml,及巴比妥缓冲液,0.1ml,，再加入,氯化钙,溶液观察凝固时间。以凝固时间最短的一管所加的氯化钙量，为复钙试验的氯化钙溶液用量。,（,3,）测定法,取小试管加入上述倍比稀释的供试品溶液各,0.1ml,，再依次加入上述,6-,氨基己酸溶液和血浆各,0.1ml,，轻轻摇匀，在,25,水浴中，静置,2,3min,，迅速加入已预温至,25,的复钙试验所需的上述氯化钙溶液用量，混匀，记录放入时间。注意观察血浆凝固，观察时轻轻倾斜，避免影响凝血过程，记录凝固时间。,空白对照管凝固时间减去供试品管凝固时间等于,复钙试验凝固缩短时间,。,在单对数纸上，以供试品溶液的,浓度为纵坐标，以复钙试验凝固缩短时间（,s,）为横坐标,，绘图，连接不同稀释度的供试品各点，应成一直线，此直线外延至纵轴，,与纵轴的交点即表示供试品浓度，也是凝血质样活性为零值时的供试品酶活力，按每,1ml,中供试品的单位表示，每,1ml,应大于,150U,。,90,（四）,效价测定,(,气泡上升法,),原理：激活,纤维蛋白溶酶原,使其转化成,纤维蛋白溶酶，纤维蛋白溶酶,具有较强的蛋白水解酶的能力。,纤维蛋白原,在,凝血酶,的作用下，转变成纤维蛋白凝块，此凝块在纤维蛋白溶酶作用下，水解为可溶性小分子多肽。在纤维蛋白溶酶原过量的情况下，,尿激酶量与纤维蛋白凝块的溶解时间的对数成直线关系,。,91,操作,92,计算：,以尿激酶的浓度为横坐标，以反应时间的对数为纵坐标,。,注意：,影响效价测定的主要因素是,纤维蛋白溶酶原、凝血酶及纤维蛋白原,，如发现标准曲线斜率低于,0.3,，直线平坦，则纤维蛋白溶解酶原、凝血酶可能失活，需重新标定或更换。,效价测定过程中，各试剂需置,37,水浴中。,93,第三节 酶活力测定方法,固定时间法,连续监测法,（一）、需,NAD,+,或,NADP,+,作指示的连续监测法：,直接测定法,偶联法,三联酶活测定,（二）、不需,NAD,+,或,NADP,+,作指示的连续监测法：,固定浓度法,94,第四节 酶活性测定方法的设计,一、影响因素,二、底物与产物的测定方法,三、,测定条件的选择,1,、,单因素选择,2,、,正交设计,多因素选择,95,第五节,酶类药物的检测,肽键水解酶,1,、,胰蛋白酶,2,、,弹性蛋白酶,3,、,尿激酶,（,气泡上升法,）,脂键水解酶,胰脂肪酶,糖苷键水解酶,溶菌酶,其它,（,超氧化物歧化酶，门冬酰胺酶,）,