第五讲-基因芯片检测技术-PPT.ppt

第五讲 基因芯片检测技术基因芯片检测技术2 2简介当当荧荧光光染染料料被被激激发发光光激激发发后后，便便会会产产生生荧荧光光光光子子，荧荧光光的的强强弱弱代代表表了了荧荧光光化化合合物物的的含含量量，因因此此可可以以用用光光探探测测器器对对产产生生的的荧荧光光进进行行定定量量检检测测，以以确确定定荧荧光光化化合合物物的的含含量量，从从而而计计算算出出D DN NA A或或R RN NA A的的含含量量。生生物物芯芯片片的的扫扫描描是是指指将将与与目目标标D DN NA A（或或R RN NA A）杂杂交交后后、或或与与目目标标抗抗原原、抗抗体体、或或受受体体等等目目标标靶靶分分子子反反应应结结合合后后的的生生物物芯芯片片上上成成千千上上万万个个点点阵阵的的生生物物反反应应结结果果阅阅读读出出来来，转转变变成成为为可可供供计计算算机机处处理理的的数数据据。3 3简介根据生物芯片所使用的标记物不同，相应的信号根据生物芯片所使用的标记物不同，相应的信号检测方法有放射性同位素法、生物素标记法、荧检测方法有放射性同位素法、生物素标记法、荧光染料标记法等。光染料标记法等。目前基因芯片最普遍采用的标记和检测法是荧光目前基因芯片最普遍采用的标记和检测法是荧光法，相应的检测装置主要有激光共聚焦显微镜、法，相应的检测装置主要有激光共聚焦显微镜、CCDCCD相机、激光扫描荧光显微镜、激光共聚焦扫描相机、激光扫描荧光显微镜、激光共聚焦扫描仪等。仪等。基因芯片检测系统可以分为硬件系统和软件系统基因芯片检测系统可以分为硬件系统和软件系统两个部分，由于常用的基因芯片检测系统采用扫两个部分，由于常用的基因芯片检测系统采用扫描的方式得到图像，因此又称为基因芯片扫描仪。描的方式得到图像，因此又称为基因芯片扫描仪。4 4扫描仪5 5基因芯片检测仪芯片检测体系的硬件部分主要包括：照明光源、光路系统、光探测器、机械部分和A/D转换器等。6 6照明光源当荧光化合物或者染料受到特定波长的激发光激发后，会吸收激发光子，然后发射荧光光子。选择光源（荧光染料激发光的光源）遵循两个原则：一是为了提高检测的灵敏度，需要选择高强度的激发光源，以激发较多的荧光光子，二是激发光的波长范围要避免将其所激发的荧光波长覆盖。7 7荧光染料与荧光光谱各各种种荧荧光光化化合合物物有有各各自自特特定定的的最最大大激激发发光光吸吸收收波波长长和和最最大大发发射射波波长长。两两峰峰值值波波长长差差值值称称为为斯斯托托克克斯斯位位移移(S St to ok ke es s s sh hi if ft t)。斯斯托托克克斯斯位位移移太太小小，激激发发光光和和发发射射荧荧光光的的光光谱谱有有较较大大部部分分重重叠叠，影影响响对对荧荧光光强强度度的的测测量量精精度度。实实际际中中，选选取取斯斯托托克克斯斯位位移移较较大大的的荧荧光光材材料料。C Cy y3 3 5 55 50 0-5 57 70 0n nmm 2 20 0n nmm C Cy y5 5 6 64 49 9-6 67 70 0n nmm 2 21 1n nmm荧荧光光强强度度在在一一定定范范围围内内与与激激发发光光的的强强度度成成正正比比。荧荧光光分分子子受受到到激激发发后后，以以球球状状方方式式发发射射荧荧光光光光子子8 8大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点9 9激光光源单单色色性性好好、方方向向性性好好、能能量量集集中中、亮亮度度高高、相相干干性性好好、能能产产生生强强度度较较高高的的发发射射荧荧光光，可可以以大大大大地地提提高高检检测测灵灵敏敏度度为为了了同同时时检检测测多多种种荧荧光光，在在具具体体实实现现过过程程中中，光光源源系系统统都都设设计计成成多多波波长长结结构构，通通常常采采用用多多个个激激光光器器。气气体体激激光光器器，比比如如氦氦氖氖激激光光器器，输输出出连连续续光光，输输出出光光束束质质量量很很好好，单单色色性性好好，稳稳定定性性高高，输输出出光光为为可可见见光光。半半导导体体激激光光器器，波波长长范范围围广广。体体积积小小，质质量量轻轻，价价格格便便宜宜。1010非激光光源非激光光源，波长范围比较宽。为了避免激发光对荧光的干扰，通常需要加装滤光片来选择与荧光最大激发波长相吻合的光。要检测多种荧光，采用多个滤光片来选择多种特定的波长低氩汞灯和短弧氙灯。1111照明方式照明区域是线和面，可以同时激发大面积的荧光，实现光强的均匀性，主要是非激光光源。激光高相干性，在较大面积上光强很难一致。一般激光光源为点照明方式，为了实现大面积成像，必须通过扫描来实现。1212131314141515光路系统光光收收集集：荧荧光光收收集集多多采采用用光光学学透透镜镜系系统统，透透镜镜收收集集光光的的立立体体角角的的大大小小直直接接影影响响系系统统的的效效率率 。透透镜镜收收集集光光的的效效率率以以数数码码孔孔径径（N NA A）表表示示。N NA A为为1 1.0 0，表表明明透透镜镜收收集集了了整整个个半半球球面面的的光光，相相对对应应的的光光收收集集效效率率为为5 50 0。多多数数共共聚聚焦焦激激光光微微阵阵列列扫扫描描仪仪物物镜镜的的N NA A为为0 0.5 50 0.9 9，而而绝绝大大多多数数C CC CD D阵阵列列扫扫描描仪仪的的N NA A为为0 0.2 20 0.5 5。激激发发/发发射射光光的的识识别别和和分分离离：由由于于荧荧光光发发射射强强度度要要远远远远小小于于激激发发光光强强度度，因因此此要要从从激激发发光光中中检检测测出出微微弱弱的的荧荧光光信信号号，就就需需要要对对这这两两种种类类型型的的光光进进行行分分离离。1616激发/发射光的识别和分离 几几何何分分离离：根根据据激激发发光光和和荧荧光光光光路路的的几几何何关关系系进进行行分分离离。一一种种方方式式用用一一个个很很小小的的反反光光镜镜将将激激发发光光束束反反射射，而而让让环环形形部部分分的的荧荧光光光光束束通通过过；另另一一种种方方式式是是激激发发光光束束和和系系统统光光路路不不同同轴轴，在在成成像像过过程程中中，激激发发光光束束所所成成的的像像和和荧荧光光光光束束所所成成的的像像会会发发生生分分离离，从从而而过过滤滤掉掉激激发发光光束束。但但由由于于光光学学系系统统各各种种表表面面的的反反射射和和散散射射，会会使使部部分分激激发发光光混混入入检检测测系系统统中中，通通常常的的解解决决办办法法是是在在探探测测器器前前放放滤滤光光片片对对荧荧光光进进行行过过滤滤。波波长长分分离离：根根据据激激发发光光和和荧荧光光的的波波长长差差异异进进行行分分离离。根根据据激激发发光光波波长长和和荧荧光光波波长长不不完完全全重重合合的的事事实实，用用滤滤光光片片将将其其分分离离。1717激发光的入射角度芯片不平整，芯片表面的灰尘，片基不均匀，环境中芯片不平整，芯片表面的灰尘，片基不均匀，环境中的尘粒都会引起光的强烈散射，产生散射光，另外入的尘粒都会引起光的强烈散射，产生散射光，另外入射光照在芯片上也产生反射光。但干涉滤光片不能完射光照在芯片上也产生反射光。但干涉滤光片不能完全滤除散射光与反射光。全滤除散射光与反射光。检测角度确定时，杂质微粒引起的散射光的强度与入检测角度确定时，杂质微粒引起的散射光的强度与入射光角度有关。入射光与检测角成射光角度有关。入射光与检测角成0 0度时最强，度时最强，9090度度时最弱。时最弱。但生物芯片扫描仪难以实现与入射光成但生物芯片扫描仪难以实现与入射光成9090度的检测，度的检测，因为荧光检测必须在芯片的正上方，与芯片垂直，以因为荧光检测必须在芯片的正上方，与芯片垂直，以保证最大的采光量并避免芯片荧光图像的失真。保证最大的采光量并避免芯片荧光图像的失真。入射光与检测成入射光与检测成0 0度是激光系统芯片扫描仪常采用的度是激光系统芯片扫描仪常采用的方式。方式。CCDCCD系统芯片扫描仪及部分激光系统扫描仪多系统芯片扫描仪及部分激光系统扫描仪多采用入射光与检测成采用入射光与检测成4545度或度或135135度的方式。度的方式。1818光漂白现象 光光漂漂白白是是指指荧荧光光染染料料分分子子在在激激发发光光的的照照射射下下，其其产产生生荧荧光光的的强强度度随随着着时时间间的的延延长长逐逐渐渐变变弱弱消消失失的的过过程程。几几乎乎所所有有的的荧荧光光染染料料都都存存在在这这种种光光漂漂白白现现象象,光光漂漂白白的的程程度度随随光光照照强强度度的的增增加加和和照照射射时时间间的的延延长长而而增增强强。激激光光系系统统扫扫描描仪仪中中，聚聚焦焦后后的的激激光光束束直直径径较较小小，一一般般在在5 51 10 0m m，光光强强较较大大，因因此此光光漂漂白白的的作作用用较较强强。C CC CD D系系统统虽虽然然激激发发光光较较弱弱，但但C CC CD D扫扫描描时时通通常常采采用用长长时时间间曝曝光光方方式式，因因此此也也同同样样存存在在光光漂漂白白现现象象。1919在生物芯片扫描中，通常一次扫描产生的光漂白在生物芯片扫描中，通常一次扫描产生的光漂白并不显著，可以忽略，但是多次重复扫描产生的并不显著，可以忽略，但是多次重复扫描产生的光漂白必须考虑。光漂白必须考虑。Cy3Cy3多次扫描测定，平均每扫描一次，荧光强度下多次扫描测定，平均每扫描一次，荧光强度下降降0.7%0.7%。可见光漂的作用还是比较强的。可见光漂的作用还是比较强的。2020光探测器光探测器是基因芯片扫描仪检测系统的核心器件，其主要用途是探测荧光光子，并把荧光光子的光信号转变成模拟的电信号。目前基因芯片扫描仪所选用的光探测器件各不相同，主要有基于用PMT（photomultiplier tube，光电倍增管）和CCD（charge-coupled devices，电荷偶合器件）作为感光器件的两种 2121光电倍增管（PMT）2222光电倍增管（PMT）增益依赖于光电倍增管内部光阴极的数量和加在光电倍增管上的电压，光阴极的数量多、电压高则增益大。芯片扫描仪用光电倍增管的选择应考虑下列两个因素。一是由于不同的光阴极模式对不同的波长的光的灵敏度不一样，因此应选择对被测荧光波长灵敏度高的光电倍增管；而是应选择耐用的高信噪比的光电倍增管。2323PMT的优点和缺点PMTPMT的优点的优点 ：光电倍增管在可见光波范围内是最：光电倍增管在可见光波范围内是最灵敏的探测器，通过改变电压可以很方便地改变灵敏的探测器，通过改变电压可以很方便地改变光电倍增管的灵敏度；一般用激光作为激发光源，光电倍增管的灵敏度；一般用激光作为激发光源，能激发出较强的荧光，增加灵敏度能激发出较强的荧光，增加灵敏度 ；通过点成像；通过点成像探测并结合高速探测并结合高速XYXY轴扫描而实现对生物芯片进行轴扫描而实现对生物芯片进行扫读，均一性好扫读，均一性好 ；可以与共聚焦系统相兼容以降；可以与共聚焦系统相兼容以降低背景噪声低背景噪声 。PMTPMT的缺点的缺点 ：由于采用点成像探测及：由于采用点成像探测及XYXY轴扫描，轴扫描，成像速度较慢，一般需要成像速度较慢，一般需要1010分钟以上分钟以上 ；虽然激光；虽然激光光源使用寿命可以达到几千小时以上，但光源随光源使用寿命可以达到几千小时以上，但光源随着使用时间的延长而老化，其强度逐渐减弱，导着使用时间的延长而老化，其强度逐渐减弱，导致灵敏度随着使用时间的延长而降低。致灵敏度随着使用时间的延长而降低。2424CCD的优点和缺点CCDCCD的优点的优点 ：CCDCCD一次可成像很大面积的区域，激一次可成像很大面积的区域，激发光源多采用氙灯或高压汞灯等高亮度光源，在发光源多采用氙灯或高压汞灯等高亮度光源，在单一光源下可通过更换滤光片的方式来满足激发单一光源下可通过更换滤光片的方式来满足激发不同荧光的需要不同荧光的需要 ；由于；由于CCDCCD芯片扫描仪时能同时芯片扫描仪时能同时对整张芯片表面信号进行读取，不需要对整张芯片表面信号进行读取，不需要X-YX-Y二维移二维移动平台，大大提高了获取荧光图像的速度，使得动平台，大大提高了获取荧光图像的速度，使得这种扫描速度相对比这种扫描速度相对比PMTPMT激光扫描仪要快，一般仅激光扫描仪要快，一般仅需要需要0.5-20.5-2分钟分钟 。缺点缺点 ：样品点受到的激发光可能不够均匀一致，：样品点受到的激发光可能不够均匀一致，从而引入测量误差从而引入测量误差 ；CCDCCD对微弱信号的放大功能对微弱信号的放大功能不及光电倍增管，因而需要额外的放大系统来将不及光电倍增管，因而需要额外的放大系统来将信号放大才能达到光电倍增管的灵敏度范围的上信号放大才能达到光电倍增管的灵敏度范围的上限限 。2525其他器件A AD D转换器转换器 ：将：将PMTPMT或或CCDCCD收集的模拟的电信号转收集的模拟的电信号转化为数字图像信号。化为数字图像信号。载片台：固定和放置微阵列固相基质的装置，多载片台：固定和放置微阵列固相基质的装置，多芯片数扫描仪载片台的大小只能适合标准显微载芯片数扫描仪载片台的大小只能适合标准显微载玻片玻片 。机械传动装置机械传动装置 ：生物芯片检测仪根据相对激光器：生物芯片检测仪根据相对激光器及探测器是否移动分为扫描检测和固定检测。及探测器是否移动分为扫描检测和固定检测。CCDCCD检测仪大多采用固定检测，检测仪大多采用固定检测，PMTPMT扫描仪则是以单束扫描仪则是以单束固定波长的激光来扫描，因此需要激光头或载片固定波长的激光来扫描，因此需要激光头或载片台的机械运动来使激光扫到整个面积台的机械运动来使激光扫到整个面积 绝大部分激光共聚焦生物芯片扫描仪采用了载片绝大部分激光共聚焦生物芯片扫描仪采用了载片台移动的检测方法，即将激光器及光探测器固定，台移动的检测方法，即将激光器及光探测器固定，生物芯片置于载片台并随着载片台在生物芯片置于载片台并随着载片台在X X方向正反线方向正反线扫描和扫描和Y Y方向步进向前运动方向步进向前运动 2626有关检测系统的重要参数 信噪比：荧光信号的峰值除以信号的变异。信噪比太低，则表示信号有较大的变异，所得到的结果就不能反映实际的信号值。2727噪声来源 暗暗电电流流噪噪声声：没没有有光光输输入入时时的的噪噪声声。暗暗电电流流主主要要是是由由器器件件的的缺缺陷陷和和热热力力学学导导致致的的量量子子涨涨落落引引起起，因因此此降降低低系系统统温温度度，可可有有效效地地降降低低暗暗电电流流的的量量值值。发发射射噪噪声声：光光输输入入过过程程中中产产生生的的噪噪声声。越越多多的的光光子子导导致致越越多多的的光光子子数数量量的的变变异异，因因此此，发发射射噪噪声声的的绝绝对对数数量量随随着着信信号号的的增增加加 而而增增加加。直直接接来来自自于于器器件件的的物物理理性性质质，因因此此很很难难避避免免。此此外外，基基因因芯芯片片也也会会引引入入噪噪声声，如如基基因因芯芯片片基基片片玻玻璃璃质质地地或或空空气气中中灰灰尘尘的的荧荧光光本本底底干干扰扰，基基因因芯芯片片基基片片与与标标记记样样本本之之间间的的非非特特异异杂杂交交等等，都都会会引引入入一一定定的的荧荧光光噪噪声声。2828灵敏度与动态检测范围 灵敏度是指扫描仪测定最微弱荧光的能力。通常用灵敏度是指扫描仪测定最微弱荧光的能力。通常用每平方微米能测定的荧光分子数来表示灵敏度。目每平方微米能测定的荧光分子数来表示灵敏度。目前商业生物芯片扫描仪的灵敏度可达前商业生物芯片扫描仪的灵敏度可达0.10.11 1荧光分荧光分子子/m/m2 2。动态范围是指仪器能够响应超过噪音水平的信号强动态范围是指仪器能够响应超过噪音水平的信号强度的范围。仪器的动态范围是仪器所有组件共同作度的范围。仪器的动态范围是仪器所有组件共同作用的结果，影响信号的动态范围的因素很多，主要用的结果，影响信号的动态范围的因素很多，主要由荧光的物理特性、由荧光的物理特性、CCDCCD的动态工作范围和的动态工作范围和A AD D转转换器的动态范围等因素决定。对于激光系统，其动换器的动态范围等因素决定。对于激光系统，其动态范围可达态范围可达1616位（位（bitbit），即），即2 216 16(即即65536)65536)灰度值灰度值（9696分贝）。对于分贝）。对于CCDCCD系统，由于不同器件的噪声系统，由于不同器件的噪声强度差别很大，一般动态范围为强度差别很大，一般动态范围为12121616位，即位，即2 212161216（4096-655364096-65536）灰度值（）灰度值（7272分贝分贝-96-96分贝）。分贝）。2929灵敏度范围很重要 虽然通常扫描仪的灰度值在虽然通常扫描仪的灰度值在0-655350-65535之间，有很大的动态之间，有很大的动态范围，但调节仪器的灵敏度范围对于基因芯片来讲仍是很范围，但调节仪器的灵敏度范围对于基因芯片来讲仍是很重要的重要的 。第一，在不同的样本之间，由于样本第一，在不同的样本之间，由于样本RNARNA的质量、标记效的质量、标记效率和杂交效率等原因，使不同样本之间的荧光强度变化很率和杂交效率等原因，使不同样本之间的荧光强度变化很大；第二，在同一样本内部，不同的基因表达丰度相差极大；第二，在同一样本内部，不同的基因表达丰度相差极大，高丰度的大，高丰度的mRNAmRNA可以占可以占mRNAmRNA中中1 1的丰度，而一些微量的丰度，而一些微量表达的基因只占表达的基因只占mRNAmRNA中百万分之一以下的丰度。中百万分之一以下的丰度。如果扫描仪的灵敏度范围设置不当，会出现两种情况：第如果扫描仪的灵敏度范围设置不当，会出现两种情况：第一：扫描强度太弱，总体信号太弱，弱信号点（无效点）一：扫描强度太弱，总体信号太弱，弱信号点（无效点）比例太高，对于大量的低丰度表达基因无法测出；第二：比例太高，对于大量的低丰度表达基因无法测出；第二：扫描强度太大，总体信号太强，导致大量的点信号达到饱扫描强度太大，总体信号太强，导致大量的点信号达到饱和，饱和点的信号会导致两种荧光信号比值压缩，无法分和，饱和点的信号会导致两种荧光信号比值压缩，无法分析差异表达基因，另外，大强度扫描还会导致高背景及激析差异表达基因，另外，大强度扫描还会导致高背景及激光管迅速老化。光管迅速老化。3030调整仪器灵敏度范围的方法 其一是改变激发光的强度，如用激光衰减器可调整改变激发光的强度其可调范围至少为100：1其二是改变光探测器的灵敏度，如果PMT扫描仪，则改变光电倍增管的灵敏度，通过变化输入电压的大小，光电倍增管的灵敏度改变范围至少为100：1对于CCD检测系统，改变镜头的数字光圈可以提高采光效率，从而改变检测灵敏度。3131像素与分辨率 像像素素是是构构成成图图像像的的最最小小单单元元，即即图图像像上上不不同同颜颜色色或或灰灰度度的的点点，这这些些点点组组合合起起来来形形成成一一幅幅完完整整的的图图像像。在在C CC CD D上上为为C CC CD D的的最最小小感感光光单单元元，其其大大小小通通常常在在几几个个微微米米到到十十几几个个微微米米，通通过过成成像像公公式式可可换换算算成成检检测测芯芯片片上上对对应应区区域域的的大大小小。对对于于激激光光系系统统，像像素素的的大大小小为为激激光光光光斑斑的的尺尺寸寸，可可以以通通过过改改变变光光斑斑直直径径来来改改变变像像素素的的大大小小。分分辨辨率率是是指指能能够够区区分分的的最最近近两两个个点点的的最最小小距距离离 。像像素素的的大大小小决决定定了了分分辨辨率率的的高高低低，像像素素越越大大，分分辨辨率率越越高高，分分辨辨率率越越高高则则图图像像越越清清晰晰，定定量量的的准准确确度度就就越越高高，可可以以提提供供更更精精细细的的具具有有统统计计意意义义的的数数据据。3232像素与分辨率激光系统扫描仪的分辨率主要是由激光的聚焦直激光系统扫描仪的分辨率主要是由激光的聚焦直径决定的，分辨率一般为径决定的，分辨率一般为5 51010。CCDCCD系统扫系统扫描仪的分辨率主要决定于描仪的分辨率主要决定于CCDCCD像素的数目，一次成像素的数目，一次成像型像型CCDCCD扫描仪的分辨率一般为大于或等于扫描仪的分辨率一般为大于或等于20m20m，多次扫描拼接成像型则可达，多次扫描拼接成像型则可达2.5m2.5m。3333扫描仪控控制制和和自自动动化化系系统统是是由由电电脑脑来来完完成成的的 。图图形形化化的的操操作作界界面面使使得得初初学学者者只只需需接接受受简简单单的的训训练练或或阅阅读读操操作作手手册册就就能能够够使使用用仪仪器器，因因此此扫扫描描仪仪使使用用者者并并不不需需要要精精通通扫扫描描仪仪的的光光学学和和电电子子学学部部分分 控控制制软软件件具具有有许许多多自自动动设设置置功功能能，如如不不同同的的用用户户扫扫描描不不同同样样品品可可设设置置、保保存存、再再现现扫扫描描参参数数；可可自自动动设设定定2 2个个以以上上的的扫扫描描激激光光波波长长并并自自动动保保存存图图像像结结果果；对对某某一一扫扫描描波波段段自自动动调调整整灵灵敏敏度度、激激发发光光强强度度、及及探探测测器器探探测测范范围围等等。34343535商品化生物芯片扫描仪 激光共聚焦扫描仪激光共聚焦扫描仪 ScanArray ScanArray系列、系列、SureScanSureScan芯片扫描仪、芯片扫描仪、DNAscope DNAscope 系列。系列。激光非共聚焦扫描仪激光非共聚焦扫描仪 GenePix GenePix 系列系列CCDCCD基因芯片检测仪基因芯片检测仪 AlphaArray AlphaArrayTMTM 基因芯片扫描分析系统、基因芯片扫描分析系统、GeneTACGeneTAC扫描仪、扫描仪、SpotWare SpotWare 基因芯片扫描仪基因芯片扫描仪 、ArrayWoRx“e”ArrayWoRx“e”扫描仪扫描仪 国产扫描仪国产扫描仪 成都中科百奥科技有限公司成都中科百奥科技有限公司 SCAN-1SCAN-1、北京博奥、北京博奥生物芯片有限责任公司生物芯片有限责任公司EcoSCANTM-100 EcoSCANTM-100 3636扫描过程应注意的问题由由于于芯芯片片扫扫描描仪仪有有极极高高的的灵灵敏敏度度和和分分辨辨率率，芯芯片片上上很很小小的的尘尘埃埃或或杂杂质质污污染染都都会会引引起起非非常常明明亮亮的的背背景景和和噪噪音音，因因此此在在芯芯片片的的制制作作，杂杂交交和和清清洗洗过过程程中中都都应应在在洁洁净净的的环环境境中中进进行行，最最好好在在洁洁净净台台或或者者洁洁净净间间操操作作，并并注注意意防防静静电电。芯芯片片完完成成杂杂交交和和清清洗洗后后应应尽尽可可能能立立即即扫扫描描测测定定，防防止止荧荧光光标标记记靶靶分分子子降降解解。杂杂交交后后的的芯芯片片应应避避免免长长期期暴暴露露在在强强光光下下，因因而而导导致致光光漂漂白白，影影响响测测定定结结果果。芯芯片片扫扫描描中中由由于于有有机机械械传传动动装装置置，因因此此仪仪器器应应放放置置在在平平稳稳坚坚固固的的平平台台上上，并并注注意意防防止止外外源源性性震震动动。3737芯片图像处理3838灰度图最原始的图谱是黑白的，显现的是灰度值，一般扫描仪所最原始的图谱是黑白的，显现的是灰度值，一般扫描仪所得到的图谱为得到的图谱为1616位的位的TifTif、JpegJpeg、RawRaw等格式的图像（也有等格式的图像（也有些扫描仪能得到更高的些扫描仪能得到更高的2424位的图像），每个像素的灰度值位的图像），每个像素的灰度值在在0-655350-65535之间的范围内，每个灰度值都反应了图像所对之间的范围内，每个灰度值都反应了图像所对应芯片位置的荧光分子相对强度信息。应芯片位置的荧光分子相对强度信息。3939伪彩图在扫描仪配套的扫描软件中一般都内建有能将原在扫描仪配套的扫描软件中一般都内建有能将原始的灰度图改为伪彩图的功能。由于肉眼对区分始的灰度图改为伪彩图的功能。由于肉眼对区分同种颜色的不同强度（灰度）并不敏感，因此就同种颜色的不同强度（灰度）并不敏感，因此就人为的将灰度值根据其数值大小转化成不同颜色，人为的将灰度值根据其数值大小转化成不同颜色，以便于肉眼观察扫描图谱时便能一目了然的区分以便于肉眼观察扫描图谱时便能一目了然的区分出同一张芯片上各种基因的相对信号强弱。出同一张芯片上各种基因的相对信号强弱。4040叠加图对于基因表达谱芯片，为了便于对于基因表达谱芯片，为了便于扫描完毕就能大致判断芯片中是扫描完毕就能大致判断芯片中是否有上调或下调的差异基因，有否有上调或下调的差异基因，有些扫描或分析软件中还提供叠加些扫描或分析软件中还提供叠加图的功能。它是将同一张芯片所图的功能。它是将同一张芯片所对应的两种不同杂交样本扫描所对应的两种不同杂交样本扫描所得图谱分别转变成绿色和红色的得图谱分别转变成绿色和红色的图谱。一般对照样本（通常用图谱。一般对照样本（通常用Cy3Cy3标记）被转变为绿色，而实标记）被转变为绿色，而实验样本（通常用验样本（通常用Cy5Cy5标记）被转标记）被转变为红色。当两张图谱叠加在一变为红色。当两张图谱叠加在一起时，每个基因点的最终色彩由起时，每个基因点的最终色彩由两种颜色的比率而决定，两种颜色的比率而决定，4141如果点的颜色为红色，说明该基因在实验样本中的表达量比对照样本中的表达量高，该基因为上调基因；如果最终基因点的颜色为绿色，则该基因在实验样本中的表达量比对照样本中的表达量低，该基因为下调基因；如果最终基因点的颜色为黄色，该基因没有显著变化。42424343多Block的芯片芯片图像上的点象芯片图像上的点象格子一样排列。有格子一样排列。有些芯片的图像还包些芯片的图像还包括几个部分，每个括几个部分，每个部分含有相同行和部分含有相同行和相同列的点的子格，相同列的点的子格，并且每个子格之间并且每个子格之间的距离大概相等，的距离大概相等，所有的子格合在一所有的子格合在一起就是一整张芯片。起就是一整张芯片。4444理想的芯片图像理想的芯片图像：（1）所有子格大小相同。（2）子格之间距离相等。（3）子格中行和列之间的距离应当相等。（4）点中心的位置应在行线和列线的交点处。（5）点的形状是个圆，并且所有圆的大小相同。（6）片子上没有灰尘或者其他污染。（7）图像背景均一而且值很小。实际情况和这种理想情况往往有很大偏离。4545实际的偏离点位置偏移：原因在于芯片生产过程中的机械方点位置偏移：原因在于芯片生产过程中的机械方面。每个点之间的间隔可能会不一致。另外还有面。每个点之间的间隔可能会不一致。另外还有机器人系统，点样仪器的不精确和放置片子的托机器人系统，点样仪器的不精确和放置片子的托盘的稳定性不好，还有一些点位置不易确定。盘的稳定性不好，还有一些点位置不易确定。点大小和形状不规则：点样时点大小和形状不规则：点样时DNADNA溶液的液滴大小溶液的液滴大小不同，导致点的大小也不同。另外，液滴中不同，导致点的大小也不同。另外，液滴中DNADNA浓浓度和盐的浓度不同，点的形状可能与圆相差很大。度和盐的浓度不同，点的形状可能与圆相差很大。在一个点所对应的圆内，各处在一个点所对应的圆内，各处DNADNA密度也不尽相同。密度也不尽相同。污染：灰尘的污染，样品中核酸、蛋白质、细胞污染：灰尘的污染，样品中核酸、蛋白质、细胞和组织碎片的污染，扫描得到的图像有的并不和组织碎片的污染，扫描得到的图像有的并不“干净干净”，存在较大的杂质亮点或者部分区域的污，存在较大的杂质亮点或者部分区域的污染。染。全局性的因素：片子本身的不均匀性，芯片表面全局性的因素：片子本身的不均匀性，芯片表面烘干时的不均匀以及芯片扫描仪本身存在的系统烘干时的不均匀以及芯片扫描仪本身存在的系统噪音噪音4646ArrayGene软件图像处理47474848494950505151525253535454样点的识别和位置的确定(Addressing or gridding)确定样点的大概位置通常的做法是根据芯片阵列确定样点的大概位置通常的做法是根据芯片阵列的行和列的数目的行和列的数目(一般会由芯片制造者事先给定一般会由芯片制造者事先给定)，由计算机自动生成一个网格（，由计算机自动生成一个网格（griddinggridding），每），每个格对应一个样点，这个网格为每个点提供了一个格对应一个样点，这个网格为每个点提供了一个相对位置的坐标。其次还要对网格进行定位，个相对位置的坐标。其次还要对网格进行定位，确定网格在图像上的位置。确定网格在图像上的位置。在网格生成之后，还得对样点进行识别。有的图在网格生成之后，还得对样点进行识别。有的图像处理软件在网格交点出设计一个圆，每个圆套像处理软件在网格交点出设计一个圆，每个圆套住一个样点。有的设计成方格形，然后在方格内住一个样点。有的设计成方格形，然后在方格内再产生一个圆，每个圆套住一个样点。实际上芯再产生一个圆，每个圆套住一个样点。实际上芯片样点的大小并不一致，因此有些软件会根据特片样点的大小并不一致，因此有些软件会根据特定的计算方法逐步调节圆的位置和大小，使圆正定的计算方法逐步调节圆的位置和大小，使圆正好能套住样点。好能套住样点。55555656样点的识别和位置的确定整个芯片图像可能是由好几个块组成，各个子块的位置可能还需要微调。有时候片子中图像有些歪斜，而计算机生成的网格是横平竖直的，需要将片子旋转，旋转的角度也是一个重要参数。5757手动定位网格生成步骤中，用户可以手动将格子框架放到图像中，并可以调整网格，使之与样点能尽量对齐。由于图像中的点的间隔并不均一，用户可能要逐条调整网格线，使之与点对齐。一个芯片图像有成千上万个样点，手动定位非常费时费力；对样点间隔不均一的片子和样点大小差别很大的片子，人为的错误会带来很大的误差。5858半自动定位 用用户户可可能能需需要要将将格格子子覆覆盖盖在在图图上上，调调整整格格子子大大小小，使使之之与与点点的的位位置置大大致致匹匹配配，或或者者需需要要告告诉诉程程序序图图像像中中格格子子的的四四个个角角。算算法法就就能能自自动动的的调调整整格格子子线线，和和各各个个点点，从从而而来来定定位位样样点点 节节省省时时间间；即即便便信信号号强强度度很很弱弱，也也能能识识别别出出来来。在在点点之之间间间间隔隔不不均均一一的的情情况况下下也也能能很很好好的的识识别别信信号号点点；能能正正确确识识别别真真正正信信号号点点旁旁边边的的污污染染物物 5959自动定位 图像处理的最终目的：建立一个完全自动的方法，图像处理的最终目的：建立一个完全自动的方法，能利用成熟的计算机图像识别算法，在不需要任能利用成熟的计算机图像识别算法，在不需要任何人工干预的情况下识别信号点。何人工干预的情况下识别信号点。BioDiscoveryBioDiscovery公司已经发展了一个公司已经发展了一个AutoGeneAutoGene工具。工具。这个工具只需要用户事先定好片子的一些参数这个工具只需要用户事先定好片子的一些参数（就是，行和列的数目），它将自动的在图像中（就是，行和列的数目），它将自动的在图像中找到正确的网格位置。找到正确的网格位置。极大的减少人工干预，最大限度的减少由于人工极大的减少人工干预，最大限度的减少由于人工参与而带来的误差，保证了数据的质量参与而带来的误差，保证了数据的质量 6060图像的分割(Segmentation)计算机可视化术语。指确定属于计算机可视化术语。指确定属于前景（信号）（前景（信号）（foregroundforeground）和）和背景（背景（backgroundbackground）的像素）的像素在信号点定位之后，点和点周围在信号点定位之后，点和点周围的一部分区域内的像素就用来计的一部分区域内的像素就用来计算背景和前景强度。算背景和前景强度。方法按照像素的信息可以分为三方法按照像素的信息可以分为三类：基于像素空间位置的分割；类：基于像素空间位置的分割；基于像素强度的分割；综合像素基于像素强度的分割；综合像素强度和空间信息的分割。强度和空间信息的分割。SignalBackground6161基于像素空间位置的分割利利用用信信号号点点定定位位结结果果的的空空间间信信息息来来分分开开属属于于信信号号的的像像素素和和属属于于背背景景的的像像素素。相相应应位位置置上上的的圆圆将将信信号号和和背背景景分分开开。圆圆内内的的像像素素是是信信号号，而而圆圆外外则则是是背背景景。这这种种方方法法已已经经被被许许多多图图像像分分析析工工具具所所采采用用，适适合合快快速速且且粗粗略略的的分分析析图图像像数数据据。但但是是，在在许许多多芯芯片片图图像像中中点点的的大大小小和和形形状状都都是是不不规规则则的的，而而且且污污染染也也大大量量存存在在，这这种种情情况况下下，用用这这种种方方法法分分割割会会带带来来很很大大的的误误差差，不不能能保保证证足足够够的的准准确确性性。6262按照信号点几何形状的三种分割方法l l固定圆分割固定圆分割l l可调圆分割可调圆分割 可调形状分割可调形状分割6363基于像素强度的分割 所有像素按强度由小到大排所有像素按强度由小到大排列。假如不存在污染的话，列。假如不存在污染的话，强度值大的就认为是信号点强度值大的就认为是信号点像素。像素。柱状图法：用一个框架柱状图法：用一个框架（maskmask）包含相应点，在框）包含相应点，在框架内的像素强度就形成一个架内的像素强度就形成一个柱状图。当像素强度值大于柱状图。当像素强度值大于一个阈值的时候，这些像素一个阈值的时候，这些像素就可以认为是前景值，反之，就可以认为是前景值，反之，则认为是背景值。则认为是背景值。简单而且速度快简单而且速度快 得到的前景像素往往不相连，得到的前景像素往往不相连，对于噪音大的点和弱信号点对于噪音大的点和弱信号点这种方法不适合这种方法不适合 BkgdForegroundBackground:mean between 5th and 20th percentileForeground:mean between 80th and 95th percentile6464综合像素强度和空间信息的分割 在信号点位置画一个大小适合的圆，圆内的像素暂时先认为是信号，圆外认为是背景。计算两个区域中像素强度的统计上的差异，并进行比较来分割出信号。Mann-Whitney检验法和修剪法 6565Mann-Whitney检验法 根根据据背背景景像像素素的的统统计计性性质质来来确确定定在在圆圆内内哪哪些些像像素素是是信信号号，M Ma an nn n-W Wh hi it tn ne ey y检检验验法法用用来来确确定定强强度度水水平平的的阈阈值值。圆圆内内像像素素的的强强度度超超过过这这个个阈阈值值就就认认为为是是信信号号。圆圆内内存存在在污污染染的的时时候候，这这些些污污染染的的像像素素也也会会被被认认为为是是信信号号。假假如如在在圆圆外外有有污污染染的的像像素素或或者者点点的的位位置置没没有有准准确确地地确确定定以以至至于于一一些些信信号号的的像像素素在在圆圆外外面面，这这些些高高亮亮度度的的像像素素会会提提高高阈阈值值水水平平，在在圆圆内内的的一一些些强强度度低低的的信信号号像像素素也也会会被被归归类类成成背背景景像像素素。处处理理噪噪声声大大的的片片子子和和弱弱信信号号点点时时候候，效效果果不不是是很很好好。6666修剪（trimmed off）法 由由于于信信号号点点的的不不规规则则，在在圆圆外外可可能能有有一一些些像像素素是是信信号号，在在圆圆内内也也有有一一些些像像素素是是背背景景。污污染染的的像像素素也也是是误误差差点点。为为了了消消除除这这些些误误差差点点的的影影响响，可可以以简简单单地地修修剪剪掉掉（t tr ri imm o of ff f）一一部部分分信信号号和和背背景景像像素素。圆圆内