对低浓度模板的扩增-昆明医科大学.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,许冰,莹,Tel,:,0871-65922837；,13769175605,E,mail:bingying_xu,昆明医科大学法医学院,第二节 聚合酶链式反应,p,olymerase,c,hain,r,eaction,PCR,教学内容和目的要求：,掌握,PCR,的原理,掌握,PCR,的反应体系和方法,熟悉,PCR,在法医学的应用,聚合酶链式反应,polymerase chain reaction,PCR,一种模拟人体,DNA,半保留复制原理，在体外扩,增特异性目的,DNA,片段的技术，经过,PCR,，可在数小时内，使目的,DNA,片段获得百万个的拷,贝，便于后续的分析和检测。,What is PCR?,PCR,(,Polymerase Chain Reaction,，聚合酶链式反应,),Polymerase-,P,Chain-,C,Reaction-,R,Kary B Mullis,PCR was invented in 1983 by Dr.Kary B Mullis,for which he received the Nobel Prize in Chemistry in 1993.,一,.PCR,原理,（,PCR principle,）,在体外，以一对人工合成的特异性寡核苷酸为引物，四种脱氧核苷酸为底物，以待测目的,DNA,为模板，在,DNA,聚合酶的催化作用下，通过高温变性、低温退火、中温延伸的温度循环，选择性扩增目的,DNA,片段，经过,30,个循环周期后，目的,DNA,片段达到百万倍的扩增。,The PCR principle,PCR is just like DNA replication in vivo.,a pair of oligonucleotides-primers,（引物）,dNTP-substrate,（底物）,Target,DNA-template,（模板）,Taq DNA polymerase-enzyme,（酶）,Denaturation,（变性）,-,高温,Annealing,（复性）,-,低温,Extension,（延伸）,-,中温,The PCR procedure,The Reaction,Thermal Cycler,PCR tubes,DNA Denaturation,（,DNA,变性）,通过加热（,94,）使模板,DNA,双链间氢键断裂，双链解离形成两条单链,DNA,的过程。,DNA Annealing,（,DNA,退火）,又称,DNA,复性，将反应体系降温（,60,），引物与单链模板,DNA,按照碱基互补配对的原则重新形成模板,-,引物杂化双链的过程。,DNA Extension,（,DNA,延伸）,DNA,聚合酶在适当温度条件下（,72,）催化,4,中,dNTP,原料按照碱基互补配对原则从引物的,3,末端开始渗入，延模板有,5,3,方向延伸，合成一条新的,DNA,链的过程。,DNA template,95,Denaturation(heat to 95,o,C),95,50-60,Antisense Primer,Sense Primer,Anneal with primers(lower to 50-60),PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,50-60,72,Taq,酶,Taq,酶,Extension(increase to 70,o,C),Antisense,Primer,Sense,Primer,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,72,The first cycle,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,95,65,72,Taq,Taq,Taq,Taq,The second cycle,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,DNA template,20,30 cycles,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（,min,）,温度,（,）,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复,1,3,步,25,30,轮,目的,DNA,片段,扩增,100,万倍以上,DNA,双螺旋,DNA,单链,与引物复性,DNA,变性,形成,2,条单链,子链延伸,DNA,加倍,预变性,(93-95,C,2-5m),变性,(93-95,C,30s),退火,(50-70,C,30s),延伸,(75,C,30-60s),总延伸,(75,C,7m),(25-35),PCR,的一般过程：,经过,30,次的循环,扩增的,DNA,片段可达,100,万倍以上。,二,.PCR,反应体系,Taq,DNA,聚合酶,(,Taq,DNA polymerase,),引物,(primer),dNTP(A,、,T,、,C,、,G),模板,(template),Mg2+,（,PCR buffer,）,标准的,PCR,反应体系（,100,l,）,4,种,dNTP,混合物 各,200,mol/L,（,A,、,C,、,T,、,G,）,引物,各,10,100pmol,（上游引物、下游引物）,模板,DNA,0.1,2,g,Taq,DNA,聚合酶,2.5u,缓冲液,Mg,2+,1.5mmol/L,KCl,50mmol/L,Tris-HCl(Ph8.4)10mmol/L,0.001%,明胶或牛血清蛋白,Whats in the Tube,Target DNA,5,3,3,5,primers,A,B,dNTP,Taq,DNA,polymerase,Mg,2+,Mg,2+,Mg,2+,Mg,2+,Mg,2+,Mg,2+,Buffer,containing,magnesium,1.Taq,DNA,聚合酶,（,Taq,DNA polymerase,）,最适温度：,72,，,半衰期：,92.5,130min,；,95 40min,；,97.5,5,6min,。,酶量增加使反应特异性下降,;,酶量过少影响反应产量。,1.Taq DNA,聚合酶,（,Taq,DNA polymerase,）,水生栖热菌,(thermus aquaticus,Taq),的,DNA,聚合酶。,5,3,DNA,聚合酶活性；无,3,5,外切酶活性，没有引物,3,端错配碱基的校正功能，,35,轮循环有,0.25%,错配,，,与原始模板,有差别。,人工合成的寡核苷酸序列,与靶,DNA,片段两侧翼的序列互补。,引物序列限定了,PCR,产物的长度和特异性。引物浓度一般为,0.1,0.5,mol/L,。,2.,引 物（,primer,）,例如,IL-3,：,5,GCTCCATGA,-,-TGAGTCCAA,3,正链,-,ACTCAGGTT,5,负链,上游引物,：,与其,53,端的序列相同,5-GCT CCA TGA-3,下游引物：相应互补链,5,3,序列相同,5-TTG GAC TCA-3,靠近,5,上游,Primer,与双链,DNA,正链相同，,3,下,游,Primer,与负链相同。,引物设计原则：,（,1,）序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。,（,2,）引物长度以,15-30,bp,为宜。,（,3,）,碱基尽可能随机分布,，,G+C,占,50-60%,。,（4）引物内部避免形成二级结构。,（5）两引物间避免有互补序列。,（6）引物3,端为关键碱基；,5,端,无严格限制。,3.,模 板,(template),单、双链,DNA,均可。,模板的要求,：,（,1,）,不能混有蛋白酶、核酸酶、,DNA,聚合酶抑制剂、,DNA,结合蛋白（组蛋白）等杂质。,（,2,）模板适量。,（,模板浓度过高会导致反应的非特异性增加，浓度过低则降低反应产量）。,dNTP,浓度取决于扩增片段的长度,一般终浓度：,dNTP,浓度在,20,200,mol/L,浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量。,四种,dNTP,必须浓度相等,4.,dNTP,5.,Mg,2+,Mg,2+,是,DNA,聚合酶的激活剂。,0.5mmol/L-2.5mmol/L,反应体系，,一般常用,1.5mmol/L,终浓度。,Mg2+,浓度过低会使,Taq,酶活性丧失；,Mg,2+,过高影响反应特异性。,Mg,2+,可与负离子结合，所以反应体系中,dNTP,、,EDTA,等的浓度影响反应中游离的,Mg,2+,浓度。,三,.,热循环参数对,PCR,的影响,变性温度与时间,退火温度与时间,延伸温度与时间,循环次数,1.,变性温度与时间,一般,93,94lmin,足以使模板,DNA,变性,若低于,93,则需延长时间,但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性,有影响。,此步若不能使靶基因模板完全变性，就会导致,PCR,失败。,2.,退火,(,复性,),温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成（,GC,含量）及其浓度，还有靶序列的长度。,退火温度是影响,PCR,特异性的重要因素：,增加温度能减少引物与模板的非特异性结合,;,降低温度可增加反应的灵敏性。,复性时间,:,一般为,30,60sec,，足以使引物与模板之间完全结合,.,延伸温度：,一般在,70,75,之间，常用温度为,72,。,此时,TaqDNA,聚合酶活性最高。,延伸时间：靶序列长度,1Kb,以内的,DNA,片段，延伸时间,1min,（,足够）,-,扩增,10Kb,需延伸至,15min,延伸时间过长会导致非特异性扩增。,对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。,3.,延伸温度和时间,4.,循环次数,主要取决于模版,DNA,的浓度。,一般为,25-35,次。,次数过多：扩增效率降低，错误掺入率增加。,5.PCR,技术的特点,High sensitivity-,灵敏度高,High specificity-,特异性高,Template DNA purity and integrity,requirements is not high-,对模板,DNA,的纯度及完整性要求不高,Species specificity-,种属特异性好,Simple,fast-,简便、快速,电泳分离,PCR,扩增,DNA,提取,PCR-STR,基本分型技术,银染显带,荧光显带,基因分型,