第18章-基因诊断与基因治疗.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第 十 八 章,基因诊断与基因治疗,Gene Diagnosis and Gene Therapy,南方医科大学基因工程研究所,生物化学与分子生物学教研室,周珏宇,zhoujueyu,1,主要内容,基因诊断,1,基因治疗,2,2,教 学 要 求,【,教学课时,】,2,学时,【,掌握内容,】,基因诊断的含义、特点；基因治疗的概念。,【,熟悉内容,】,基因诊断的各种常用技术方法；基因治疗的载,体系统与导入方法。,【,了解内容,】,基因诊断、基因治疗在医学中的应用,3,基因变异致病类型,内源基因的变异,基因结构突变,基因表达异常,外源基因的入侵,4,第 一 节基 因 诊 断,Gene Diagnosis,5,一、基因诊断的概念和特点,定义,利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测,基因结构及其表达水平,是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。,6,特点,1.,特异性高，针对性强,2.,灵敏度高,:,3.,早期诊断,4.,取样方便,5.,安全高效,6.,适应范围广,一、基因诊断的概念和特点,7,二、基因诊断常用技术方法,（一）核酸分子杂交技术,（二）聚合酶链反应,(PCR),（三）基因测序,（四）生物芯片,8,（一）核酸分子杂交技术,概念,核酸分子杂交技术是依据,DNA,双链碱基互补、变性和复性原理，用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针检测样本中是否存在与其互补的同源核酸序列。,9,10,分类,固相杂交,：将待检测核酸样本先行结合到某种固相支持物上，再与杂交液中的特异性标记探针进行杂交反应，然后漂洗去除未参加反应的核酸探针。,液相杂交,：待测的核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中进行反应。,11,杂交,分离、变性、转移、固化,DNA,片段,标记核酸探针,制备待测核酸样品,制备核酸探针,分子杂交操作程序,预杂交,加入标记核酸探针,漂洗除去未参与杂交的标记探针,检测杂交信号,12,核酸探针,是指带有标记的某一特定,DNA,或,RNA,片断，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列。,探针标记物,有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、荧光素等）两大类。,13,常用的固相核酸杂交方法,Southern,印迹杂交、,Northern,印迹杂交、菌落杂交、斑点杂交（狭缝杂交）、原位杂交、夹心杂交等。,14,Southern,印迹,由英国人,Southern(1975),发明，将琼脂糖中的,DNA,转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上进行,DNA,分子杂交分析的方法。,15,是经典的,RNA,分析法，用于组织细胞中总,RNA,或,mRNA,的定性和定量分析。过程类似于,Southern blotting,。,Northern,印迹,16,放射自显影照片,17,Western,印迹,用于蛋白质的分析,聚偏二氟乙烯,辣根过氧化物酶,18,三种印迹技术的比较,19,菌落杂交（,colony hybridization,）,该法可从大量细菌中筛选含特异的,DNA,序列及基因工程重组体。,20,硝酸纤维膜,复制培养,溶菌、中和,蛋白酶处理,漂洗、烘干,1,、,32,P,探针,2,、放射自显影,鉴定克隆,（含感兴趣,DNA,）,菌落杂交,硝酸纤维膜,菌落,琼脂培养板,21,夹心杂交法,(sandwich hybridization),A,B,A,B,A,B,RE,RE,片段,B,捕获探针,固相支持物,片段,A,检测探针,(,标记,),22,原位杂交（,in situ hybridization,）,将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂,交，进而检测特异的,DNA,或,RNA,序列。,细胞原位杂交,组织切片原位杂交,该法优点：,不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态。,23,小鼠大脑皮层,mRNA,原位杂交,细胞原位杂交,24,1988 Saiki,1988 Keohanog,1985 Mullis,1971 Korana,耐热,DNA,聚合酶,T4 DNA,聚合酶,聚合酶链式反应,(Klenow,片段,),核酸体外扩增设想,（二）聚合酶链反应技术,1.,发展简史,25,PCR,技术让,Mullis,荣获,1993年度诺贝尔化学奖。,26,2.PCR,基本原理,利用体内,DNA,复制的原理和,DNA,变性与复性的性质进行目的基因的大量扩增。,在模板、,dNTP,、,Mg,2+,等条件下，用耐热的,Taq,酶代替,DNA,聚合酶，用合成的,DNA,引物代替,RNA,引物，经过,DNA,变性、引物与模板结合（复性）和延伸,3,个步骤的循环过程，实现,对目的,DNA,的,扩增。,27,变性,95,C,延伸,72,C,退火,Tm-5,C,溶液反应温度升至中温,72,，在,Taq,酶作用下，以,dNTP,为原料，引物为复制起点，模板,DNA,的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链,加热使模板,DNA,在高温下90-95,变性，双链解链,降低溶液温,度，使合成,引物在低温,（,35,70,一般低于模板,Tm,值的,5,左右），与模板,DNA,互补退火形成部分双链,3.PCR,的基本反应步骤,28,5,Primer 1,5,Primer 2,Cycle 2,Cycle 1,5,5,5,5,5,5,Template DNA,5,5,5,5,5,5,5,5,PCR,技术原理示意图,29,Cycle 3,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,25,30,次循环后，模板,DNA,的含量可以扩大,100,万倍以上,。,30,PCR,技术原理示意图,31,这样经过,一个周期,的,变性,复性,延伸,等三步反应就可以产生,倍增的,DNA,，,反复,n,个周期,后，理论上就能扩增为,2,n,倍,，一般经过,3040,周期就能扩增,100,万倍以上。,32,4.PCR,的特点,特异性强,灵敏度高,PCR,产物的生成量是以指数方式增加的，能将,pg=10,-12,级的起始待测模板扩增到微克,(,g=10,-6,),水平,简便、快速,PCR,反应一般在,2,4,小时完成扩增反应,对标本的纯度要求低,DNA,粗制品可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体液、毛发、细胞、活组织等扩增检测,33,模板,(DNA/RNA),耐热,DNA,聚合酶,特异性引物,缓冲液与,Mg,2+,dNTP,浓度、比例,参数,5.PCR,各要素及其作用,34,模板：,PCR,模板可以是,DNA,或,RNA,。以线性,DNA,模板为佳，起始量一般为,10,2,10,5,个拷贝；模板量合适可以减少,PCR,多次循环所致的碱基错配的发生率。,耐热,DNA,聚合酶：,最重要因素之一，主要有,Taq,DNA,聚合酶等。是从耐热菌体内提取的一种,DNA,聚合酶，可在,95,稳定,30,min,。,35,缓冲液与,Mg,2,：,10,50,mmol,/L,Tris-HCl,（,pH 8.3,8.8,，,20,C,）；,Mg,2,过低，酶活力明显降低；,Mg,2,浓度过高时，使反应特异性降低。,dNTP,：,原料。高浓度易产生错误掺入，而浓度过低，则降低反应产物的产量。常用浓度为,50,200,mol/L,36,引物：,是根据已知序列的模板,DNA,待扩增区两端而设计的一对寡核苷酸小片断，长度一般为,15,30,个碱基。,引物是,保证,PCR,扩增产物的大小和特异性的关键因素，其设计与合成对,PCR,的成功至关重要。,37,1.,引物的长度一般为,1530,bp,2.G,C,含量一般为,4060,3.,引物的碱基成分应尽量随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶堆积的现象,4.,引物不应有自身互补序列,5.,两个引物之间不应有多于,4,个的互补,6.,引物的延伸是,在,3,端开始，,3,端不能进行任何修饰,7.,引物,5,端可修饰,8.,引物与非特异结合区之间的同源性不要超过,70,引物设计的基本要求,38,PCR,反应参数,变性温度与时间,退火温度与时间,退火温度决定,PCR,的特异性；,Tm-5C,延伸温度与时间,Taq,DNA,聚合酶活性最高温度；,35-100,bp,/min,循环次数,主要取决于模板,DNA,的浓度；平台期,39,凝胶电泳分析法,6.PCR,产物分析,点杂交分析法,40,（三）生物芯片（,biochip,）,采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量,生物大分子,比如,核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞,等生物样品有序地固化于支持物（如,玻片、硅片、尼龙膜,等载体）的表面，组成密集的二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器（比如激光共聚焦扫描仪）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。,41,叠加图：绿色代表下调；红色代表上调；黄色无差异。,正常样品,Cy3,标记,待测样品,Cy5,标记,叠加,石奕武，胡维新等：多发性骨髓瘤的基因表达谱分析，,湖南医科大学学报，,2003,，,28,（,3,）：,201,205,42,1.,芯片的制备,Gene probes,（,cDNA,、,DNA,）,substrate,Ready-to-use,microarray,Oligo,probes,A,G,C,T,or,arrayer,43,Sample cells,Extract RNA or DNA,2)RT or PCR amplification,3)Fluorescent labeling,Reference cells,Sample ready,combine,Labeled RNA or DNA(Sample),Labeled RNA or DNA(Reference),2),1),3),1),2),3),2.,基因表达谱双色标记,44,3.,分子杂交,1)hybridize,Apply sample,2)rinse,45,4.,检测分析,Laser 1,Laser 2,Detector 1,Detector 2,Scanner,芯片的扫描,46,5.,图 像 处 理,Detector 1,Detector 2,False-color differential image,47,6.,图 像 分 析,48,49,50,（四）基因测序,是最直接、最确切的基因诊断方法。,Maxam,-Gilbert,法,（化学裂解法）,Sanger,法,（双脱氧末端终止法）,DNA,自动测序法,弗雷德里克 桑格,51,化学裂解法,(,Maxam,-Gilbert,法,),基本原理,基于某些化学试剂可以使,DNA,链在,1,个或,2,个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的,DNA,片段，将这些片段经电泳分离。,分析前，用同位素标记,DNA,的,5,末端，经放射自显影即可在,X,胶片上读出,DNA,链的序列,。,52,Sanger,法（,双脱氧,末端终止法）,以待测,DNA,单链为模板，在,DNA,聚合酶作用下，加入,4,种,dNTP,和,4,种,ddNTP,（双脱氧核糖核酸）,dNTP,和,ddNTP,竞争参与,DNA,互补链的合成,当,ddNTP,取代,dNTP,的位置后，,DNA,链的合成终止,电泳图谱分析，确定碱基顺序,图谱中读出的顺序是待测链的互补碱基顺序,53,双脱氧核苷酸结构,54,Sanger,法（双脱氧末端终止法）,读出模板互补序列,dNTP,凝胶电泳,较大片段,较小片段,ddGTP,ddATP,ddCTP,ddTTP,反应混合物,Klenow,酶,未知序列的单链,DNA,读出待测序列,CTGACTTCGACAA,AGAA,5,3,放射性标记的引物,TGTT,A C T G,ddG,ddG,ddG,ddG,GACTGAAGCTGTT,3,5,CTGACTTCGACAA,5,3,55,DNA,自动测序法,设计原理：,Sanger,法为基础,荧光标记物：,不同颜色的荧光分 别代表,A,、,G,、,C,、,T,电泳,电信号,显示,56,57,三、基因诊断的应用,遗传病,产前诊断、优生优育,肿瘤,了解恶性肿瘤的分子机制，对肿瘤分类分型及预后有指导意义。,感染性疾病,具有快速、灵敏、特异等优点。,法医学中个体识别、亲子鉴定,有些具有个体特征的遗传标记可用于个体识别和亲,子鉴定，如,DNA,指纹分析、短串联重复（,STR,）多态性,分析等。,58,Mst,酶切位点,(CCTNAGG),5,3,正常基因,5,3,突变基因,1.15kb,1.35kb,镰刀状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析,bA,CCT G,A,G,G,AG,bA,CCT G,T,G G,AG,b-,珠蛋白基因第六密码子,GAG(Glu,),GTG(Val,),59,+,0.2kb,1.15kb,1.35kb正常人,突变携带者,患者,60,杜氏肌营养不良症,(DMD),的基因检测,DMD,是一种高发病率、高致残、高致死的,X,染色体连锁的遗传性疾病，在,2500,个活产男婴中即有一个患者。,致病基因,DMD,的全长为,250kb,，,有,79,个外显子。,DMD,的最主要遗传缺陷是外显子缺失，约占,60%70%,。,61,DMD,基因外显子缺失的检测,62,1.,DNA Marker 2.,阳性对照,3.,孕妇,1.,DNA Marker 2.,阳性对照,3.,孕妇,4.,胎儿,5.,阴性对照,4.,胎儿,5.,阴性对照,采用多重,PCR,法扩增该基因的多个外显子,63,Southern blot,应用,DNA,指纹分析,血迹中的,DNA,64,第 二 节 基 因 治 疗,Gene Therapy,65,一、基因治疗的概念,经典概念,(,狭义概念,),：将具有正常功能的基因,置换或增补患者体内缺陷的基因，从而达到治,疗疾病的目的。,广义概念,：将某些遗传物质转移至患者体内，,使其在体内表达，最终达到治疗某种疾病的方,法，均称之为基因治疗。,66,腺苷脱氨酶,(ADA),缺乏的严重联合免疫缺陷,(SCID),杰西,吉尔辛,67,腺苷脱氨酶,(ADA),缺乏的严重联合免疫缺陷,(SCID),68,69,70,二、基因治疗的总体策略,基因矫正,基因置换,基因增补,基因失活,自杀基因的应用,免疫基因治疗,耐药基因治疗,71,基因矫正,(gene correction),是指将致病基因的突变碱基加以纠正，而保留正常部分。,基因置换,(gene replacement),指用正常基因通过同源重组技术，原位替换致病基因，使细胞内的,DNA,完全恢复正常状态。,72,基因增补,(gene augmentation),是指不去除异常基因，将有功能的正常基因导入病变细胞或其它细胞后发生非定点整合，表达正常产物以补偿缺陷基因的功能，或使原有的功能得以加强。,基因失活,(gene inactivation),是将特定的反义核酸（反义,RNA,、反义,DNA,）和核酶导入细胞，在转录和翻译水平阻断某些基因的表达，而实现治疗的目的。多用于抗肿瘤和抗病毒感染的治疗。,73,“自杀基因”的应用：,HSV-TK,自杀基因又称前体药物酶转化基因，这种基因导入受体细胞后可产生一种酶，它可将原来无细胞毒性或低毒药物前体转化为细胞毒性物质，将细胞本身杀死，这种基因被称为“自杀基因”。,自杀基因导入肿瘤细胞后，可将肿瘤细胞杀死。但对正常细胞则无伤害作用。,74,免疫基因治疗：,是把产生抗病毒或者肿瘤免疫力对应的抗原决定族基因导入机体细胞，以达到治疗目的。如细胞因子基因治疗、免疫增强基因疗法、肿瘤,DNA,疫苗疗法等。,耐药基因治疗：,在肿瘤治疗中，为提高机体耐受肿瘤化疗药物的能力，把产生抗药物毒性的基因导入人体细胞。如将多药耐药基因,MDR-1,导入骨髓造血干细胞，减少骨髓受抑制的程度，以加大化疗剂量，提高化疗效果。,75,基因治疗的方式,根据基因导入的方式分为两种：,1.,直接体内疗法（,in vivo,）,是指将目的基因直接导入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。,2.,间接体内疗法（,ex vivo,）,是指在体外将目的基因导入靶细胞，经过筛选和增殖后将细胞回输给患者，使该基因在体内有效地表达相应产物，以达到治疗的目的。,76,基因治疗的两种途径,载体,目的基因,in vivo,ex vivo,靶细胞,77,三、基因治疗的基本程序,治疗性基因的获得,基因载体的,选择,靶细胞的选择,基因转移方法,转导细胞的选择鉴定,利用载体中的标记基因,回输体内,病毒载体,非病毒载体,体细胞,生殖细胞,化学法、物理法、病毒载体系统、膜融合法等,78,（一）治疗性基因的获得,导入的治疗基因应是与缺陷基因相对应的有功能的同源基因或与缺陷基因无关但有治疗意义的基因。,79,（二）基因载体的选择,基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患者体内、并能调控其适度表达。,病毒载体,：,逆转录病毒,(RV)、,腺病毒,(AV)、,腺相关的病毒(,AAV),等。,非病毒载体,：这类载体的发展较快，目前主要是脂质体。,80,（三）靶细胞的选择,-间接体内疗法中使用,-分为生殖细胞和体细胞两大类,现阶段只限于应,用体细胞,靶细胞选择的原则:,1.易操作;,2.易培养;,3.易接受外源基因;,4.在体内能持久高效表达,目前常用的靶细胞包括：成纤维细胞、淋巴细胞、上皮细胞、造血细胞、肝细胞、肌细胞等,81,（四）基因转移方法,化学方法,磷酸钙沉淀法、,DEAE-,葡聚糖法,物理方法,电穿孔法、粒子轰击法,病毒法,主要通过携带有外源基因的病毒载体感染靶细胞来实现基因的转移。,膜融合法,细胞融合法、脂质体介导法、原生质体融合法、微细胞核介导法等,82,83,84,85,（五）转导细胞的选择和鉴定,标记基因技术,基因缺陷型受体细胞技术,基因共转染技术,分子杂交技术,外源基因表达鉴定,86,（六）回输体内,方式：静脉注射、肌注、皮下注射、滴鼻等,基因修饰的淋巴细胞以静脉注射的方式回输到血液中；,将皮肤成纤维细胞以细胞胶原悬液注射至患者皮下组织；,采用自体骨髓移植的方法输入造血细胞；,或以导管技术将血管内皮细胞定位输入血管等。,87,四、基因治疗的现状与展望,（一）基因治疗应满足的条件,1,、单基因缺陷疾病,2,、仅限体细胞的基因治疗,3,、靶细胞易获取、培养、及回输体内。,4,、治疗效果应胜过对病人的危害。,5,、表达水平无需调控且无副作用。,6,、需经动物实验验证安全可行。,88,四、基因治疗的现状与展望,（二）基因治疗有待解决的问题,1,、难以获得真正有治疗作用的基因。,2,、外源基因的表达难以在体内精确调控。,3,、体细胞经体外培养后，其生物学特性会,有改变。,4,、过多的外源蛋白对机体带来可能的影,响。,5,、随机整合潜在的威胁。,89,胸腺激酶基因,90,路漫漫其修远兮，,吾将上下而求索,91,复习思考题,一、名词解释,基因诊断、基因治疗、核酸分子杂交、,PCR,二、问答题,简述基因诊断的特点。,简述基因诊断常用的方法。,简述,PCR,技术原理。,92,