细胞生物反应器制药.ppt

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转基因动物,转基因动物,是指通过实验方法，人工地把人们想要研究的动物或人类基因，或者是有经济价值的药物蛋白质基因等，通常称为外源基因，导入动物的受精卵（或早期胚胎细胞），使之与动物本身的基因组整合在一起，这样外源基因能随细胞的分裂而增殖，并能稳定地遗传给下一代的一类动物。,1,外源目的基因的制备,外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞,选择获得携有目的基因的细胞,选择合适的体外培养系统和宿主动物,转基因细胞胚胎发育及鉴定,筛选所得的转基因动物品系,以绿色荧光蛋白转基因小鼠为例：,Gene construct,pEGFP-N1,载体是一种把异源性的蛋白质融合至,EGFP,的,N,端的哺乳动物表达载体，含有人类巨细胞病毒（,CMV,）启动子，,SV40 Poly A,尾，,pUC,复制起始点（原核）和,SV40,复制起始点（真核），,20,个多克隆位点，具有筛选标志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因。异源性蛋白与,EGFP,阅读框一致地克隆入,pEGFP-N1,，形成的表达重组体在,CMV,启动子启动下，表达,EGFP,和目标蛋白的融合蛋白。,波长,490 nm,的紫外线激发后，可在荧光显微镜下,观察到绿色荧光，在多种异源生物中表达且无细胞毒性。,microinjection,受精卵准备,胚胎操作过程 显微注射,假孕母鼠准备,(,养母,),胚胎移植,Transgene analysis,Biopsy,PCR analysis,Southern blot,Phenotypic analysis,Phenotypic Analysis on founders harboring GFP gene,(9.5 dpc)GFP,+,GFP,-,embryos GFP,+,tail GFP,-,GFP,+,mice,Gurdon et al,Nature,1971,(,蛙卵和小鼠胚胎注射,mRNA),-,显微注射技术的尝试,Jaenisch,，,PNAS,1974,1976,，逆转录病毒感染小鼠的,囊胚,，使病毒,DNA,整合到小鼠的基因组中，并传递给后代,-,不能广泛应用，只是少数,ES,细胞整合外源基因，部分组织有外源基因,Gordon et al,PNAS,1980;Brinster et al,Cell,1981;Costantini Wagner et al,PNAS,1981,-,显微注射技术建立，基因结构没有合理和认真的设计，不能分析基因的生理功能,第一阶段：方法的建立,Palmiter,Brinster,Hammer et al,1982,Nature,(MT-GH)-,超级小鼠,其它功能基因,-,基础研究中一直使用,Hammer et al,1985,Nature,(rabbit,sheep,pig),GH,为主，开始关注转基因动物的病理变化,第二阶段：转基因小鼠模型及,快速生长家畜,TM transgene mice,Denning et al 2001,Nat Biotech.,(GT&PrP),Dai et al,2002,Nat Biotech,(GT-out pig),Lai et al,2002,Science(GT-out pig),GT:,半乳糖转移酶,第三阶段：,异种器官移植,(pig),和乳腺反应器,外源基因导入动物细胞的方法：,转基因动物的制备：核心技是如何把目的基因转,入动物早期胚胎细胞中,原核期胚胎显微注射法,反转录病毒感染法,胚胎干细胞法,精子载体法,人工酵母染色体法,受精前卵细胞显微注射法,原核期胚胎显微注射：,创始人,Jaenish,（,1974),主要步骤：公母畜交配（或通过人工授精）获得原核期受精卵，外源裸露,DNA,通过徽注射导入受精卵，然后将徽注射后的受精卵移入受体输卵管中继续发育。,通过激素疗法使小鼠超数排卵，开始时注射雌性妊娠血清，,48,小时后再注射人绒毛膜促进腺激素，这时小鼠便会超数排卵，一般情况下,5-10,个，超 数排卵为,35,个；,与雄性小鼠交配，然后杀掉小鼠，从其输卵管内取出受精卵,将经纯化的转基因样品迅速注射入受精卵中变大雄性原核内,将,25-40,个注射了转基因的受精卵移植入代孕小鼠体内；,受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代；,从小鼠子代体内取出,DNA,样品，进行杂交，鉴定转基因的整合与否及位点；,子代小鼠间进行再交配，繁殖，观察转基因是否遗传及表达,2025/12/3 周三,细胞工程,12,2025/12/3 周三,细胞工程,13,1.,可靠性高、重复性好,2.,对于小鼠来说，产生转基因动物的效率比较高,3.,导入,DNA,片段的大小和类型不受限制,4.,转基因在代与代之间传递的稳定性好,5.,整合位点的随意性可能对转基因表达造成影响,6.,可能会出现不希望的插入突变,7开发装置和技术的花费大时间长,2025/12/3 周三,细胞工程,14,显微注射法获得转基因鼠的成活率,2025/12/3 周三,细胞工程,15,利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，从而使外源,DNA,转移至细胞中。此法简单、效率较高，广泛应用于培养细胞的基因转移。,电穿孔法实现外源基因的转移,反转录病毒感染法：,利用反转录病毒,LTRs,（长末端重复序列）区域具有转录启动子活性特点，将外源基因连接到,LTR,下部进行重组，再包装成为高滴度病毒颗粒，去直接感染受精卵或徽注入囊胚腔中，携带外源基因的反转录病毒,DNA,可以整合到宿主染色体上。,转录启动子,2025/12/3 周三,细胞工程,17缺点：,低拷贝数,需要逆转录病毒,插入,DNA,大小有限,可能产生不希望的重组,高频的镶嵌现象,逆转录病毒的序列可能干扰转基因表达,胚胎干细胞介导法：,将目的基因转移入,ES,，重新导入囊胚或经筛选后对转入外源基因,ES,进行克隆，可培育转基因个体。在小鼠上应用成熟，大动物较晚。从猪胚胎中获得了干细胞克隆系,1988,，牛的胚胎干细胞,1990,。建立大家畜,ES,细胞系仍很困难，但随着一些相关关键技术的成熟，,ES,细胞介导法将会在转基因动物的研究中起到更加重要的作用,精子载体法,直接用精子作为外源,DNA,载体的基因转移方法。精子直接与外源,DNA,混合培养，外源基因可以进入精子头部，受精后能发育成转基因动物，其整合率低（鸡为,6.0%,），但表达率高达,50%,。,许多因素影响,DNA,与精子结合。较长的,DNA,片段比较短的,DNA,片段（,150,750dp,）更容易被精子所摄取。对精子和附睾精子的清洗可提高精子与,DNA,的结合率。目前已采用阳离子脂质体介导法，脂质体借静电作用吸附于细胞表面，通过与细胞膜融合，细胞内吞而将结合的基因导入细胞。,受精前卵细胞显微注射法,Anthony,等（,1999,）尝试一种新方法：预先将小鼠精子进行破膜处理，与编码绿色荧光蛋白,GFP,报告分子的外源,DNA,短时间（,1min,）共孵育，然后徽注射入减数分裂,II,期的卵母细胞质中取得,64%,94%,转基因表达胚胎。将转,GFP,的胚胎移植，,20%,的后代表现为基因整合。,此项研究揭示，精子膜经冷冻干燥或解冻处理后，外源,DNA,可穿过外膜，吸附于内膜。因此外源,DNA,能通过精子的徽注射有效转入卵母细胞，经膜处理的携外源,DNA,精子的徽注射是一种有效的转基因手段。,2025/12/3 周三,细胞工程,21,四种方法比较,方法,显微注射,胚胎干细胞,逆转录病毒,精子介导,优点,外源基因整合效率较高，不需要载体，目的基因的长度可达,100Kb,外源,DNA,的整合率高；,整合在生殖细胞中的比例也很高。,可在整合点整合转移基因的单个拷贝；,该方法简单、方便,缺点,精密仪器，技术操作较难，易造成宿主动物基因组的插入突变,ES,细胞株不易建立，长期培养后出现分化现象；生产的转基因动物都是嵌合体,插入的基因有大小限度；嵌合性很高；外源,DNA,在动物各种组织中的分布不均,有些结果不能重复,酵母人工染色体,(,YAC,),载体是近年发展起来的新型载体,它能克隆百万对碱基的大片段,DNA,。,作为制作转基因动物载体具有以下,优点：,A.,保证大片段,DNA,的完整性,B.,提高较长外源片段在动物转基因时的整合率,C.,保证目的基因上下游的侧翼序列的完整性，因而可以消除或减弱基因整合后的位置效应,.,因此，,YAC,介导法制备转基因动物具有广阔的应用前景,酵母人工染色体,(YAC),法,一般把目的片段在器官或组织中表达的转基因动物叫动物生物反应器,（,bioreactor,），,几乎任何有生命的器官、组织或其中一部分都可经过人为驯化为生物反应器,从生产的角度考虑，生物反应器选择的组织和器官要方便产物的获得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此发展了动物乳腺生物反应器,动物血液生物反应器和动物膀胱生物反应器等。其中，转基因动物乳腺生物反应器的研究最为引人注目。,第二节 动物生物反应器,医药领域的应用,a.,抗出血药物,b.,抗凝血药物,c.,血栓治疗药物,d.,肺气肿治疗药物,e.,免疫治疗药物,f.,人型化单克隆抗体,荷兰：,GenPharm,公司用转基因牛,生产,EPO,，产值,40,亿美元,英国：,生产,1,-,抗胰蛋白酶制剂（,治疗肺气肿病）,的转基因羊,一升羊奶,6000,美元,1999,年，只有三种产品进入临床实验；到,2009,年，已经有,70,多种进入临床实验或即将进入市场。,应用转基因动物,/,乳腺生物反应器生产药用蛋白是药物生产的一种全新模式，具有投资成本低、,药物开发周期短和经济效益高等优点，将成为,21,世纪最具有巨额经济利润的新型医药产业。,动物乳腺生物反应器,通过家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉价的人体药用蛋白，是研究的热点。从,1987,年,Gordon,等在转基因小鼠乳汁中得到人组织型纤维蛋白溶酶原激活因子（,tPA,）到现在已有数十种人体蛋白在家畜乳腺中表达。,我国已构建了,30,多种乳腺特异表达载体，在表达载体构建的合理性和有效性方面取得了成效。在转基因小鼠的乳汁中，人血清白蛋白的表达量达到,3.5g/L,，人凝血因子,IX,的表达量已达到,50mg/L,以上，人,EPO,的表达量达到,100mg/L,以上，,BLG,的表达量达到,25g/L,，均属于国际领先水平。,2025/12/3 周三,细胞工程,27,应用重组,DNA,技术和转基因技术,先将外源基因置于乳腺特异性调控序列之下,再将该基因转移到尚处于原核阶段或,1,2,细胞的受精卵的动物胚胎中,经胚胎移植得到转基因乳腺表达的动物个体,通过回收乳汁获得表达产物。,动物乳腺生物反应器,表达载体的构建,制备乳腺生物反应器的关键是保证目的蛋白特异性在乳腺中的高效表达，,外源基因在乳腺表达需要有一个引导泌乳期乳蛋白基因表达的序列。,传统表达载体都是选用某种,乳蛋白基因的调控序列作为启动子元件,。这些基因的调控区主要包括,启动子区,、,增强子序列,和其他众多转录、翻译相关元件。,目前用于表达载体的启动子调控元件主要有四类乳腺定位表达调控元件：第一类是,B2,乳球蛋白,(BL G),，第二类是酪蛋白基因调控序列：第三类是乳清酸蛋白,(WAP),基因调控序列；第四类是乳清白蛋白基因调控序列。,2025/12/3 周三,细胞工程,29,目前已克隆并用作构建载体的乳蛋白基因有：,-,乳球蛋白,(BLG),基因、,Sl-,酪蛋白基因、,-,酪蛋白基因、乳清酸蛋白,(WAP),及乳清白蛋白基因。,反刍动物一般采用,牛的,-,乳球蛋白（,BLG,）基因，该基因非常稳定，并能在乳腺中特异性表达,；家兔、猪和鼠类则采用乳清酸蛋白,WAP,抗凝血药物：,抗凝血酶,第一个进入临床试验的转基因蛋白产物。,将半乳糖,-,酪蛋白的启动子和含抗凝血酶,基因序列相连，转入绵羊胚胎细胞，在转基因绵羊的乳液中得到有生物活性抗凝血酶,蛋白，产量可达,7g/L,。,2006,年,6,月,2,日上市。治疗先天性抗凝血酶缺失症病，我国,2008,年,11,月首次用乳腺生物反应器获得抗凝血酶,蛋白纯品,1-,抗胰蛋白酶,:,抑制肺气肿释放的蛋白酶对肺组织的破坏,.,是一个利用,BLG,基因构建的重组蛋白。将,BLG 5,末端,4.0kb,序列与人的,1-,抗胰蛋白酶（,1AT,）基因的,6.5kb,片段（去掉第一个内含子）融合，再连接羊的,BLG,启动子，以,pPOLY-,为载体，转入羊的胚胎细胞，可在转基因羊分泌的乳液中得到含量高达,60.0mg/ml,的重组蛋白,1AT,。,从转基因羊的羊,奶中提取出治疗心,脏病的药物人组织,型纤维蛋白溶酶原,激活因子（,tPA,）。,红细胞生成素（,EPO,）,目前国内外均采用,CHO,细胞表达生产人,EPO,，成本比较昂贵，而用转基因动物生产的,EPO,，可能是一条理想的途径。,将,EPO DNA,分别以,Hind,和,BamHI,酶切，,1%,琼脂糖凝胶电泳回收,5.4kb,的,Hin/BamHI,片段，插入,pGEM-7zf(+),载体，再将,867bp,的,-,乳球蛋白（,BLG,）启动子插入,EPO,基因之前,EcoR,、,ClaI,位点，构建表达载体,pGEM-3zf(+)-LG-EPO,。,通过显微注射方法得到转基因小鼠乳汁中的,EPO,含量可达,0.5g/ml,。,问题及展望,目前，生产实践中动物乳腺生物反应器的应用已崭露头角，但这项技术还存在着众多问题，,研发周期长、前期投资大及技术难度高等，导致所有产品都未商品化；,有关转基因动物的基础理论研究还比较薄弱；,乳腺生物反应器的异位表达和表达产物的泄露问题也需要各种新技术来解决；,人们对转基因产品安全性以及转基因技术所涉及的伦理道德问题的考虑，对转基因产品接受程度不高。,应用转基因植物生产的药物,不同转基因生物反应器的特点比较,第三节 在异种器官移植中的应用,人体器官的最佳替补,无论体积大小，还是外观形状，甚至结构功能，与人体器官最相似的应属猪的器官。因此，猪被视为异体器官移植的理想“替补”。,移植难题,猪体内存在两个,-1,，,3,半乳糖转移酶,(GT),基因,),，“,GT”,基因控制半乳糖基转移酶的产生，这种酶使猪细胞表面形成一种标记性的多糖。当猪器官或细胞被移植给人体时，人类免疫系统能识别这种糖，从而产生强烈的排异反应，把移植的器官或细胞视作外来异物进行攻击。使器官在数小时之内死亡。,解决方案,目前，科学家已经敲除了转基因克隆猪体内的一个“,GT”,基因，另一个“,GT”,基因尚有待攻克。,Dai et al,2002,Nat Biotech,(GT-out pig),Lai et al 2002,Science.,(GT out pig),下一步研究方向,1.,将培养出的小猪两两配对，由此进一步繁殖出体内两个“,GT”,基因均无功能的小猪。,2.,从两个“,GT”,基因均无功能的猪身上取下各种器官，移植到人类以外的灵长目动物身上。,3.,动物试验若能成功，人体临床实验将有望启动。,